Surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants dans les cellules recombinantes

Commencez avec une plaque multi-puits contenant des cellules de mammifères recombinantes adhérentes dans une solution de stimulation complétée par de la luciférine, un substrat luminescent.

Incuber pour permettre à la luciférine d’entrer dans la cellule.

Ces cellules expriment des récepteurs odorants liés à la membrane couplés à des protéines G olfactives et à des protéines de transport des récepteurs.

De plus, les cellules expriment des protéines Glosensor cytoplasmiques, des protéines luminescentes sensibles à l’AMP cyclique.

Ajoutez une solution odorante vaporisable dans l’espace entre les puits et placez la plaque dans un instrument luminomètre pré-équilibré avec le même odorisant.

Lancer la mesure de luminescence.

Les molécules odorantes se lient aux récepteurs odorants des cellules, activant la protéine G couplée et dissociant la sous-unité α de la protéine G, ou Gα.

La sous-unité Gα dissociée se lie à l’enzyme adénylate cyclase intégrée dans la membrane, l’activant. L’enzyme activée convertit les ATP en AMPs cycliques.

Ces AMP cycliques se lient aux protéines glosensors, modifiant leur conformation et permettant la liaison à la luciférine.

Cette interaction produit de la luminescence, confirmant l’activation des récepteurs odorants.

Ajouter 75 microlitres de la solution de réactif AMPc. Retirez la solution de stimulation des puits et ajoutez 25 microlitres de solution de réactif d’AMPc diluée dans chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits à température ambiante dans un environnement sombre et sans odeur pendant deux heures.

Tout d’abord, diluez l’acétophénone odorisant à 1 % dans 10 millilitres d’huile minérale et bouchez le tube. Avant la fin du temps d’incubation du réactif cAMP, ajoutez 25 microlitres de la solution odorante dans chaque puits dans une nouvelle plaque à 96 puits. Placez ensuite cette plaque odorante dans la chambre du luminomètre pendant cinq minutes pour équilibrer la chambre avec les molécules odorantes volatiles. Réglez le luminomètre pour enregistrer la luminescence avec zéro seconde de retard pendant 20 cycles de mesure de plaque de 90 secondes, avec 0,7 seconde d’intervalle entre les cycles.

Juste avant de lire la plaque, retirez la plaque odorante de la chambre. Dans la plaque à 96 puits contenant les cellules transfectées, ajoutez 25 microlitres d’odorant dans l’espace entre les puits et remettez rapidement la plaque dans la chambre. Démarrez la mesure de la luminescence de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 minutes.