Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:01 min • April 28th, 2025
Prenons un modèle de rat témoin anesthésié et de rat de lésion cérébrale induite par laser.
L’application laser sur l’hémisphère droit a endommagé les cellules et la barrière hémato-encéphalique, ou BBB, qui sépare le sang du tissu cérébral.
Injecte un colorant de suivi dans la veine de la queue canulée qui se déplace dans la circulation systémique pour atteindre le cerveau.
Le colorant se lie aux protéines plasmatiques et s’infiltre dans le tissu cérébral par la BHE endommagée.
Euthanasier les rats.
Perfuser les rats à travers le cœur pour éliminer le colorant de la circulation.
Extraient et découpent le cerveau, isolez les tranches de l’hémisphère blessé et homogénéisez-les.
Traitez avec une solution acide pour dénaturer les protéines, libérant ainsi le colorant lié aux protéines.
Centrifuge et isole le surnageant contenant du colorant. Ajoutez de l’alcool pour améliorer la fluorescence du colorant.
Transfère la solution dans une microplaque. Lors de l’excitation, une intensité de fluorescence plus élevée dans le cerveau blessé indique des dommages à la BHE induits par le laser.
Pour évaluer l’incidence de la rupture de la barrière hémato-encéphalique, 24 heures après la lésion induite par le laser, chargez une seringue avec un colorant bleu Evans à 2 %, dilué dans 4 millilitres par kilogramme de solution saline, et administrez la solution par voie intraveineuse aux rats blessés et témoins via la veine caudale canulée.
Laissez la solution circuler pendant une heure, avant d’utiliser des jeux d’épingles chirurgicales et des ciseaux pour ouvrir la poitrine du premier animal. Perfuser le cœur exposé, avec une solution saline refroidie à 0,9 % via le ventricule gauche à 110 millimètres de mercure de pression, jusqu’à ce qu’un liquide de perfusion incolore soit observé à partir de l’oreillette droite.
Ensuite, récoltez le cerveau et obtenez des tranches rostrocaudales de 2 millimètres. Séparez les tranches de cerveau gauche des tranches de cerveau droit pour permettre l’évaluation séparément des hémisphères blessés et non blessés, et pesez les échantillons. Homogénéiser les échantillons, à l’aide d’un mortier et d’un pilon, et incuber les échantillons de tissus dans de l’acide trichloracétique à 50 % pendant 24 heures.
Le lendemain, centrifugation des échantillons de tissu cérébral homogénéisé, pendant 20 minutes à 10 000 fois g et à température ambiante. Mélangez 1 millilitre de surnageant avec 1,5 millilitre d’éthanol à 96 % dans un rapport de 1 à 3. Ensuite, utilisez un détecteur de fluorescence à une excitation de 620 nanomètres et à une longueur d’onde d’émission de 680 nanomètres pour évaluer la rupture de la barrière hémato-encéphalique.