Localisation par fluorescence des protéines de jonction serrée et des fibres de stress dans les cellules endothéliales

Prenez une lame chambrée contenant une culture monocouche de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat, ou RBMECs, imitant la couche de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique.

Les cellules présentent des protéines de jonction serrée perturbées et des fibres de stress d’actine dues au stress dû à la privation d’oxygène-glucose suivie d’une réoxygénation.

Retirez le milieu et lavez les cellules, appliquez un fixateur pour préserver l’architecture cellulaire, puis lavez l’excès de fixateur.

Traiter avec un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Incuber avec un agent bloquant pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Pour marquer les protéines de jonction serrée, incubez avec des anticorps primaires spécifiques, puis retirez les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore pour marquer les anticorps primaires.

Sinon, pour marquer les fibres de stress, ajoutez de la phalloïdine marquée au fluorophore.

Laver pour éliminer les molécules d’étiquetage non liées.

Retirez la chambre, appliquez un milieu de montage contenant un colorant fluorescent de liaison à l’ADN pour colorer les noyaux, puis scelle