Localisation par fluorescence des protéines de jonction serrée et des fibres de stress dans les cellules endothéliales

Prenez une lame chambrée contenant une culture monocouche de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat, ou RBMECs, imitant la couche de cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique.

Les cellules présentent des protéines de jonction serrée perturbées et des fibres de stress d’actine dues au stress dû à la privation d’oxygène-glucose suivie d’une réoxygénation.

Retirez le milieu et lavez les cellules, appliquez un fixateur pour préserver l’architecture cellulaire, puis lavez l’excès de fixateur.

Traiter avec un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Incuber avec un agent bloquant pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Pour marquer les protéines de jonction serrée, incubez avec des anticorps primaires spécifiques, puis retirez les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore pour marquer les anticorps primaires.

Sinon, pour marquer les fibres de stress, ajoutez de la phalloïdine marquée au fluorophore.

Laver pour éliminer les molécules d’étiquetage non liées.

Retirez la chambre, appliquez un milieu de montage contenant un colorant fluorescent de liaison à l’ADN pour colorer les noyaux, puis scellez-le avec une lamelle.

À l’aide de la microscopie confocale, visualisez les protéines de jonction serrée et les fibres de stress marquées par fluorescence.

Commencez par exposer chaque puits de monocouches RBMEC à 100 à 200 microlitres de milieu sérique réduit Opti-MEM, et poursuivez leur incubation pendant une heure. Ensuite, lavez les lames de la chambre trois fois, en utilisant 100 à 200 microlitres de PBS par puits et par lavage. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS et incubez les lames pendant 15 minutes à température ambiante. Et lavez les cellules trois fois avec du PBS comme auparavant.

Maintenant, perméabilisez les cellules en appliquant 100 à 200 microlitres de Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS dans chaque puits. Et laissez l’assiette incuber encore 15 minutes à température ambiante. Une fois les cellules perméabilisées, appliquez la solution de blocage. Et laissez cela agir sur les cellules pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, effectuez une immunofluorescence pour la protéine ZO-1 ou marquez l’actine F. Pour effectuer l’immunofluorescence des cellules pour ZO-1, incubez-les avec l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules trois fois dans du PBS, par exemple lors du retrait du fixateur. Incuber ensuite les cellules dans 100 à 200 microlitres d’anticorps secondaire anti-lapin FITC tag pendant une heure à température ambiante, pour marquer les cellules avec de la rhodamine phalloïdine.

Après avoir appliqué la solution bloquante pendant une heure, exposez les cellules à 100 à 200 microlitres de rhodamine phalloidine dans une dilution de 1 à 50, avec 2 % de BSA PBS pendant 20 minutes. Après l’incubation de l’anticorps secondaire ou de la rhodamine phalloïdine, lavez les cellules avec du PBS trois fois comme auparavant. Retirez ensuite les chambres en décollant l’élastique. Procédez au montage des diapositives à l’aide d’un support contenant un anti-fondu et un DAPI. Imagez les cellules avec la microscopie confocale dans un seul plan avec un objectif 60x.