Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
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Prenez une diapositive avec des sections de neurosphères de tumeurs cérébrales intégrées à la paraffine, des grappes de cellules souches neurales présentant des biomarqueurs de protéines nucléaires spécifiques à la tumeur.
Chauffer pour faire fondre la paraffine, l’enlever à l’aide de xylène et réhydrater le tissu en utilisant des concentrations d’alcool décroissantes.
Chauffer dans un tampon acide contenant un détergent pour démasquer les épitopes sur les biomarqueurs et perméabiliser les membranes cellulaires.
Rincez, puis traitez avec un agent oxydant pour inactiver les enzymes peroxydases endogènes, en empêchant les signaux non spécifiques.
Applique une solution de blocage pour masquer les sites de liaison non spécifiques.
Incuber avec des anticorps primaires ciblant les épitopes du biomarqueur.
Rincez, puis traitez avec des anticorps secondaires conjugués à la biotine qui se lient aux anticorps primaires.
Rincez et incubez avec une avidine conjuguée à l’enzyme peroxydase, qui se lie à la biotine.
Ajoutez un substrat chromogène et un agent oxydant.
La peroxydase utilise l’agent pour convertir le substrat en précipités colorés, en marquant l’emplacement du biomarqueur.
Contre-colorez les noyaux, déshydratez le tissu dans de l’alcool et montez la lame pour imager la distribution des biomarqueurs.
Tout d’abord, faites fondre la paraffine en incubant les lames dans une grille métallique à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, les lames ont été déparaffinées par incubation dans un train de réhydratation à température ambiante selon le protocole Tex. Conservez les lames dans l’eau du robinet pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques. Après cela, incubez les lames dans un tampon de citrate à 125 degrés Celsius pendant 30 secondes à 90 degrés Celsius pendant 10 secondes. Laissez refroidir les lames avant de les rincer cinq fois à l’eau distillée.
Ensuite, incubez les lames à température ambiante dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les lames pendant cinq minutes trois fois dans un tampon de lavage avec une agitation douce. Incuber les lames pendant la nuit dans une chambre humidifiée réglée à 4 degrés Celsius avec un anticorps primaire dilué. Après cela, lavez les lames trois fois pendant cinq minutes en agitant doucement.
Ensuite, incubez les lames dans un anticorps secondaire biotinylé dilué à température ambiante pendant une heure. Lavez les lames trois fois pendant cinq minutes dans un tampon de lavage en agitant doucement. Ensuite, incubez les lames dans le complexe de peroxydase de raifort biotinylé avidin à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure. Répétez le lavage comme décrit précédemment. Après cela, incubez les lames avec des bandes de substrat de peroxyde d’hydrogène pendant deux à cinq minutes à température ambiante.
Rincez les lames à l’eau du robinet et trempez-les dans une solution d’hématoxyline pour les contre-tacher. Ensuite, rincez abondamment les lames à l’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire. Déshydratez les lames selon le protocole Tex. Enfin, lissez les lames avec un support de montage à base de xylène et laissez-les sécher sur une surface plane à température ambiante.