Imagerie au microscope électronique à transmission de l’endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones de l’hippocampe de souris

Commencez par traiter les neurones de l’hippocampe de souris avec un tampon à haute teneur en potassium contenant de la peroxydase de raifort ou HRP.

Un potassium élevé dépolarise les neurones présynaptiques, déclenchant l’exocytose des vésicules synaptiques. Les neurones récupèrent ensuite les membranes des vésicules synaptiques par endocytose, en incorporant la HRP dans les vésicules nouvellement formées. Fixez les neurones avec du glutaraldéhyde et lavez-les pour éliminer l’excès de glutaraldéhyde.

Ajoutez du peroxyde d’hydrogène et un substrat chromogène, qui est oxydé par HRP pour former des précipités denses en électrons. Laver pour enlever tout substrat n’ayant pas réagi.

Traiter avec du tétroxyde d’osmium pour améliorer le contraste de la membrane, puis laver l’excès de réactif. Ensuite, ajoutez de l’acétate d’uranyle pour améliorer le contraste des organites.

Déshydratez les neurones en augmentant les concentrations d’éthanol et intégrez-les dans de la résine.

Identifiez au microscope les régions denses en cellules et excisez-les. Ensuite, préparez des sections ultra-minces.

Transférez une section sur une grille en cuivre et contre-tachez-la avec des agents de contraste.

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