Name: Préparation de lADN viral à partir des nucléocapsides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Apprenez à isoler l'ADN viral de haute pureté à partir de nucléocapsides d'herpèsvirus en utilisant l'extraction au Freon et l'ultracentrifugation. Cette méthode fournit de l'ADN concentré idéal pour le séquençage à haut débit.

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Les auteurs ont apprécié les contributions de Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, et des membres du laboratoire Enquist à peaufiner ce protocole.

1. Premier jour: Infection virale et la préparation des tampons <ol><li> Préparez des plats 5-10 (15 cm de diamètre) de cellules de culture tissulaire de l'infection, par exemple cellules PK-15 pour le virus de la pseudo-rage (PRV) ou des cellules Vero pour l'herpès simplex virus (HSV). </li><li> Lorsque les cellules sont de 95 - 100% de confluence, les infecter à un (MOI) de 5-10. Pour ce faire, inoculer chaque plaque en utilisant stock de virus dans un volume total de 4 ml par plaque, puis incuber les plaques pendant 1 heure à 37 ° C. Plaques rocheuses délicatement toutes les 15 minutes afin de s'assurer que la monocouche de cellules reste entièrement recouvert par le virus de l'inoculum. Pendant ce temps, faire chauffer le support pour la prochaine étape. </li><li> Après une heure d'infection, aspirer inoculum viral à partir des plaques, ajouter 15 ml de milieu chaud, et incuber à 37 ° C pendant 12-20 heures dans un incubateur humidifié. </li><li> Préparation des tampons LCM (voir tableau 1) et le rock toute la nuit à 4 ° C pour un mélange uniforme. Préparer TNE pour la remise en suspension de l'ADN viral (voir tableau 2). </li></ol> 2. Second Jour, Phase 1: la lyse cellulaire et ultracentrifugation <ol><li> Vérifier visuellement que l'infection des cellules a causé uniforme effet cytopathogène (ECP). Permettre à l'infection de progresser jusqu'à ce que toutes les cellules ont arrondi vers le haut, mais n'ont pas soulevé de la plaque. </li><li> Racler les cellules infectées dans le milieu, et de combiner des cellules et du milieu dans des tubes coniques de 50 ml. Le nombre de tubes coniques nécessaires pour cette étape dépendra du nombre de plats utilisés pour l'infection à l'étape 1.2 ci-dessus, par exemple un tube conique de 50 ml peut être utilisée pour obtenir un culot d'un maximum de 3 plats de 15 ml de milieu de chaque option:. Rincer le plaques avec 10 ml de PBS et se combinent avec les cellules et le milieu. </li><li> Centrifuger les cellules et le milieu pendant 10 minutes à 2000 centifugal vigueur relative (fcr) à température ambiante, puis aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 10 ml de PBS. Si le culot d'une infection virale a été étendue en de multiples tubes coniques à l'étape 2.2, ceux-ci peuvent être recombinés dans un tube conique à ce step. Répétez centrifugation et aspiration en option:. Cette pastille peut être conservé à -20 ° C et le protocole poursuivie à une date ultérieure. </li></ol> 3. Deuxième jour, Phase 2: Ultracentrifugation Gardez le culot cellulaire et tampons LCM sur la glace chaque fois que possible pendant les étapes suivantes. <ol><li> Ajouter β-mercaptoéthanol à 0% de glycérol - mémoire tampon LCM. Commencez le refroidissement de la ultracentrifugeuse (pour l'étape 3.9 ci-dessous) en la fixant à 4 ° C et tournant sur le vide. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de glycérol 0% - mémoire tampon LCM jusqu'à ce qu'il ne soit plus touffue. Si nécessaire, le tube vortex de briser n'importe quelle cellule non dissous granulés. </li><li> Extraire en ajoutant 1,5 ml fréon (1,1,2-trichloro-1 ,2,2-trifluoroéthane) et vortex vigoureusement. Immédiatement centrifuger pendant 10 min à 2000 rcf à une température de 4 ° C. Recueillir la couche supérieure avec une pointe de pipette de gros calibre (en évitant l'interface) et transférer dans un nouveau tube. Optionnel: Si la pastille est un solide gélatineux, vous pouvez verser rapidement la couche supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Répéter l'extraction fréon et centrifuger à nouveau. </li><li> Recueillir la couche supérieure (~ 5 ml) et transférer dans un tube d'ultracentrifugation polyallomère nouvelle. Ajouter β-mercaptoéthanol au glycérol deux autres - tampons LCM. </li><li> Préparer un dégradé dans le tube à centrifuger polyallomère par sous-jacente de l'extrait Fréon (couche supérieure) avec 3 ml de glycérol à 5% - LCM (couche intermédiaire), puis sous-jacente à nouveau avec 2,5 ml de glycérol 45% - LCM (couche inférieure). Utiliser une pipette fine pour éviter le débordement du contenu du tube. </li><li> Si nécessaire, préparez un tube d'équilibrage équivalente en utilisant les mêmes proportions de tampons LCM. </li><li> Transfert des tubes dans des seaux ultracentrifugation. Solde seaux à 0,1 g de l'autre, en ajoutant doucement supplémentaire glycérol 0% - mémoire tampon LCM à la couche supérieure (~ 50-100 ul à la fois). </li><li> En utilisant une ultracentrifugeuse froid avec une roto godet horizontal ou oscillantr, tourner les échantillons équilibrés pendant 1 heure à 77.000 fcr (par exemple 25.000 rpm pour un rotor SW41Ti) à une température de 4 ° C. </li><li> Au cours de l'ultracentrifugation, faire un crochet verre pour capturer l'ADN flottant à l'étape de précipitation à l'éthanol (4.6). Tenez les deux extrémités d'une pipette Pasteur en verre et de suspendre la partie médiane dessus d'une flamme. Quand une section de verre est presque fondu, tirez doucement pour étirer le verre, l'incliner légèrement pour créer un crochet à angle serré (&lt;90 degrés), et tirez fermement pour sceller la fin. Si la pointe de l'hameçon en verre est ouvert, maintenez la pointe sur la flamme pour que le verre se fond assez pour la refermer. </li><li> Après l'ultracentrifugation, vous devriez voir une mince opaque à granulés avec une tache sombre au milieu. Soigneusement aspirer le liquide du tube, y compris coulures sur les côtés, mais en évitant le culot au fond du tube. </li><li> Ajouter 0,5 ml TNE à la température ambiante. </li><li> Laissez le culot reposer pendant au moins 10 minutes pour permettre l'hydratation de la pastille. Optionnel: Le culot peut aussi remettre en suspension dans du TNE du jour au lendemain, si elles sont conservées à 4 ° C. </li></ol> 4. Troisième jour: Précipitations ADN "Ghost" <ol><li> Brisez le culot par pipetage avec une pointe de petit calibre pipette (par exemple une pointe de pipette p200). Ne vous inquiétez pas à propos de cisaillement au niveau de cette étape, parce que l'ADN viral est encore contenue dans des capsides à ce stade. Ajouter les réactifs suivants dans le tube contenant le culot viral, à la température ambiante, à détruire capsides: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml SDS à 10% </li><li> 2 mg protéinase K </li></ul> Secouez délicatement pour mélanger ces réactifs. Il devrait y avoir une légère augmentation de la viscosité. </li></ol> Méfiez-vous de cisaillement à partir d'ici, par exemple, utiliser des pipettes de gros calibre et de ne pas vortexer le matériel viral <ol start="2"><li> Extraire des protéines virales en ajoutant 5 ml de phénol-chloroforme et commencer immédiatement inverser ou vortex de maintenir une émulsion. Mélanger pendant 10 secondes, puis centrifugerl'émulsion pendant 5 minutes à 2000 rcf à la température ambiante. Recueillir la couche supérieure avec une pointe de pipette de gros calibre, en évitant l'interface et le transfert dans un nouveau tube en option:. Utilisation verrouillage de phase gel (PLG) tubes de cette étape pour éviter la contamination de l'interface. </li><li> Répéter l'extraction phénol-chloroforme et centrifuger à nouveau. </li><li> Après la seconde extraction au phénol-chloroforme, recueillir la couche supérieure dans un tube de 30 ml en verre Corex et refroidir le tube à -20 ° C pendant 10-15 minutes, en prenant soin qu'il ne gèle pas. </li><li> Ajouter 10 ml d'éthanol glacé, recouvrir le tube (par exemple en étirant un morceau de parafilm M sur le dessus), et mélanger par inversion immédiatement. Surveillez un ADN "fantôme" d'apparaître, qui se compose d'un précipité visqueux mince. Inverser le tube doucement pour mélanger encore et provoquer l'ADN précipite collant à se regrouper. </li><li> Utiliser un crochet pour saisir le verre fantôme ADN (s). Soigneusement effacer l'ADN pour enlever l'excès de liquide, puis placez le crochet (pointe vers le bas)dans un tube de 1,5 ml et laisser sécher. Ajouter 0,25 - 0,5 ml de TE pour dissoudre le fantôme d'ADN. Permettre la remise en suspension de l'ADN se dérouler pendant au moins une heure. L'ADN se conserve à 4 ° C. Facultatif: Pour maximiser le rendement de l'ADN, brisez le crochet de verre dans le tube de 1,5 ml, de sorte que la remise en suspension au large des fragments de verre peuvent continuer au fil du temps. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Avec une grande suffisamment MOI, les cellules doivent atteindre la pleine CPE dans les ~ 18 heures après l'infection (hpi) pour les souches de PRV de type sauvage, et ~ 24 hpi pour type sauvage des souches de HSV-1 (figure 1). Une fois la cellule infectée culot est récolté, les étapes restantes du protocole ne peut être complète en un seul jour long ou réalisé sur deux jours (Figure 2). Lors de la préparation des crochets en verre pour capturer le fantôme d'ADN, il est important de faire l'angle d'attaque inférieur à 90 degrés, de sorte que plus tard, il peut s'adapter à la base d'un tube de 1,5 ml (figure 3). Scelle la pointe de ce crochet empêche la perte de l'ADN danscôté de la pipette. Fantômes d'ADN se former pendant l'étape de précipitation et apparaîtra comme blancs, les discussions filant (figure 4). Ces granulats et le bâton à l'autre et / ou le crochet de verre utilisée pour capturer l'ADN. Ainsi, le crochet même verre peuvent être utilisés pour rassembler plusieurs threads d'ADN à partir de la solution de précipitation. <table border="1"><tbody><tr><td> Choisir la colonne en fonction du volume désiré: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 pl </td><td> 450 ul </td><td> 600 pi </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 pi </td><td> 75 pi </td><td> 100 pi </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td pl></td><td> 15 pi </td><td> 20 pi </td><td> 40 pi </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 pi </td><td> 75 pi </td><td> 100 pi </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol (ajouter immédiatement avant utilisation) </td><td> 4,3 pl </td><td> 6,5 pl </td><td> 8,6 pl </td><td> 17,2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Utiliser des proportions pour le glycérol pour cent désirée (0, 5, ou 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glycérol </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> eau </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> Glycérol à 5% </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> eau </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> G 45%lycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> eau </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Recettes pour la préparation de tampons LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Pour un volume de 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml de NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml Tris 1 M, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml d'EDTA 0,5 </td></tr><tr><td> 41,5 ml de H 2 O </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Préparation de TNE (0,1 M de NaCl, 50 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 10 mM) <table border="1"><tbody><tr><td> Pour 1 litres </td></tr><tr><td> 0,2 g de KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g de Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O à 1L </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Préparation de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4; 137 mM NaCl; 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. PK15 cellules (A) avant l'infection, (B) à mi-chemin à travers l'infection, et (C) à l'effet cytopathogène (CPE), après une multiplicité d'infection. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Vue d'ensemble du protocole. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Trois exemples représentatifs de verre crochets utilisés pour recueillir les fantômes d'ADN viral. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Exemple représentatif d'un ADN "fantôme" bien formé et abondante.

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Certaines parties de ce protocole ont été initialement développées pour l&#39;isolement d&#39;ADN viral dans des conditions de biosécurité L4, mais elle s&#39;adapte aussi bien aux non-BSL conditions. 4 Nous communément utiliser ce protocole pour isoler l&#39;ADN du PRV alpha-herpèsvirus et le HSV-1, qui possèdent des génomes d&#39;ADN enfermé dans une capside protéique et entouré par une enveloppe lipidique. 7,8 Cependant, il est probable directement adaptable à d&#39;autres virus à ADN de grande ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Fréon (1,1,2-trichloro-1 ,2,2-trifluoroéthane) </td><td> Pêcheur </td><td> T178-4 </td><td> Vérifiez auprès de votre institution pour les directives concernant l&#39;élimination appropriée des déchets contenant du fréon, ou de voir Mendez et al. des solutions de rechange potentielles Fréon 9. </td></tr><tr><td> Tubes à verrouillage de phase gel, lourd capacité 15ml </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> En option </td></tr><tr><td> Tubes ultracentrifugation polyallomère </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Sélectionnez tubes appropriés pour votre propre ultracentrifugeuse; ceux-ci sont inclus à titre d&#39;exemple </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> Je-3021 </td><td></td></tr><tr><td> Cellules PK-15 </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Les cellules Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de l&#39;adn viral à partir des nucléocapsides

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Les virus sont des parasites cellulaires, et donc l&#39;étude de leur ADN nécessite un matériau isolant virale loin de contaminants de la cellule hôte et de l&#39;ADN. Plusieurs applications en aval nécessitent de grandes quantités d&#39;ADN viral pur, qui est prévue par le présent protocole. Ces applications comprennent le séquençage du génome viral, où la suppression de l&#39;ADN hôte est cruciale pour optimiser la production de données pour les séquences virales, et la production de nouvelles souches virales recombinantes, où la co-transfection de plasmide purifié et linéaire d&#39;ADN viral facilite la recombinaison. 1,2, 3 Cette procédure utilise une combinaison d&#39;extractions et de densité à base de centrifugation afin d&#39;isoler l&#39;ADN purifié herpèsvirus linéaire nucléocapside à partir de cellules infectées. 4,5 Les premières étapes de purification pour but d&#39;isoler capsides virales purifiées, qui contient et protège l&#39;ADN viral au cours de l&#39;extraction et les étapes de centrifugation qui éliminent les protéines cellulaires et l&#39;ADN. Lyse des nucleocapsides libère alors l&#39;ADN viral, et deux finales de phénol-chloroforme étapes éliminer les protéines restantes. L&#39;ADN capturé finale de la solution est très concentré et pur, avec une moyenne DO 260/280 de 1,90. En fonction de la quantité de cellules infectées utilisées, les rendements de l&#39;ADN viral gamme de 150 à 800 mg ou plus. La pureté de cet ADN, il est stable pendant un stockage prolongé à 4 ° C. Cet ADN est donc parfaitement adapté pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections. Avant de commencer le protocole, il est important de connaître le nombre moyen de cellules par boîte (par exemple, une moyenne de 8 x 10 6 cellules PK-15 confluentes dans un plat de 15 cm), et le titre du stock viral à utiliser ( par exemple 1 x 10 8 unités formant des plages par ml). Ceux-ci sont nécessaires pour calculer la multiplicité appropriée d&#39;infection (MOI) pour le protocole. 6 Par exemple, pour infecter une de 15 cm plat de cellules PK-15 avec le stock au-dessus virale, àune MOI de 5, vous pouvez utiliser 400 ul de stock viral et le diluer avec 3,6 ml de milieu (volume inoculation total de 4 ml pour une plaque de 15 cm). Plusieurs préparations d&#39;ADN viraux peuvent être préparés en même temps. Le nombre de préparations simultanées n&#39;est limité que par le nombre de tubes détenus par le rotor ultracentrifugeuse (un par le virus; voir l&#39;étape 3.9 ci-dessous). Nous décrivons ici la procédure comme si elle était faite pour un virus.

Nous décrivons le processus d&#39;isolation de haute pureté nucléocapside herpèsvirus ADN à partir de cellules infectées. L&#39;ADN capturé finale de la solution est de forte concentration et de pureté, qui le rend idéal pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections pour produire de nouveaux virus recombinants.

Préparation de l&#39;ADN viral à partir des nucléocapsides

Les virus sont des parasites cellulaires obligatoires, et l'étude de leur ADN nécessite donc l'isolement du matériel viral des contaminants et de l'ADN de la cellule hôte. ...

Ce vidéo montre une procédure permettant d'isoler des nucléocapsides virales et de l'ADN de haute pureté à partir de cellules infectées. Tout d'abord, les membranes lipidiques sont dénaturées à l'aide d'une extraction double au phénol. L'échantillon est ensuite soumis à une ultracentrifugation afin de former un culot contenant les nucléocapsides virales et de les séparer des composants cellulaires et viraux plus légers.Des détergents et de la protéinase K sont ajoutés pour libérer l'ADN viral des nucléocapsides en pellet. Ensuite, deux extractions au phénol-chloroforme sont effectuées afin d'éliminer toutes les protéines résiduelles. Enfin, l'ADN viral est précipité en solution.En fin de compte, les résultats montrent que l'ADN viral hautement concentré et pur a été isolé à partir de ces cellules infectées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui n'impliquent ni extractions libres ni ultracentrifugation, est que l'ADN viral obtenu présente des niveaux très faibles de contamination par l'ADN de l'hôte, ce qui le rend idéal pour des procédures ultérieures telles que la PCR et le séquençage profond des génomes viraux. Nous avons utilisé cette méthode dès les premiers jours des travaux sur l'ADN recombinant, lorsque des mesures préventives supplémentaires revêtaient une grande importance.Nous avons mis au point cette procédure afin d'isoler l'ADN viral tout en travaillant dans une boîte à gants sous des conditions de niveau de sécurité biologique quatre. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de formation du gradient et de visualisation du « fantôme » d'ADN sont difficiles à maîtriser. En effet, la superposition des couches du gradient exige une main extrêmement stable, et le « fantôme » d'ADN qui précipite en solution peut être difficile à observer si l'on ne possède pas d'expérience préalable dans sa détection.Commencez cette procédure en préparant cinq à dix boîtes de Pétri de 15 centimètres de diamètre contenant des cellules en culture tissulaire destinées à l'infection. Ici, les cellules PK 15 sont préparées pour l'infection avec le virus de la pseudo-rage lorsque les cellules atteignent une confluence de 95 à 100 % ; remplacez alors le milieu par quatre millilitres de milieu contenant le virus. Avec une MOI de cinq à dix, incubez les boîtes pendant une heure dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2, en agitant toutes les 15 minutes.Agiter doucement les plaques afin de garantir que la monocouche cellulaire reste entièrement recouverte par l'inoculum viral. Pendant l'incubation, réchauffer le milieu destiné à l'étape suivante. Après une heure d'incubation, aspirer l'inoculum viral des plaques.Ensuite, ajouter 15 millilitres de milieu tiède et incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 à 20 heures dans un incubateur humidifié. Enfin, en prévision des expériences du lendemain, préparer une nouvelle solution de tampons LCM et TNE. Remarquer que l'ajout de NP-40 entraînera la formation de rubans dans la solution acquis.Placer les solutions préparées sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, les solutions doivent être complètement intégrées. Placer la boîte sur la platine d'un microscope composé et vérifier visuellement que l'infection des cellules a provoqué un effet cytopathogène uniforme.Toutes les cellules doivent être arrondies, mais ne doivent pas s'être détachées de la plaque. Si les cellules ne sont pas encore arrondies, poursuivre l'incubation jusqu'à l'observation d'effets cytopathiques. Ensuite, racler les cellules infectées dans le milieu et rassembler les cellules dans le milieu dans des tubes coniques de 50 millilitres afin d'augmenter le rendement.Rincez les plaques avec 10 millilitres de PBS et mélangez-les avec les cellules en milieu, puis centrifugez les cellules et le milieu pendant 10 minutes à 2000 RCF à température ambiante afin d'éliminer tout milieu et sérum résiduels. Aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans 10 millilitres de PBS. Répétez la centrifugation et l'aspiration. Si l'expérience ne doit pas être poursuivie le jour même, conservez le culot à moins 20 degrés Celsius jusqu'à son utilisation pour les étapes décrites dans cette section.Il est important de garder le culot cellulaire et les tampons LCM sur de la glace autant que possible. Préparez la centrifugation ultrarapide en ajoutant de l'éthanol Beamer capto au tampon LCM contenant 0 % de glycérol afin d'obtenir une concentration finale d'éthanol Beamer capto de 0,043 %. Préparez également l'ultracentrifugeuse en la réglant à quatre degrés Celsius et en activant le vide pendant le refroidissement de l'appareil. Ajoutez cinq millilitres de tampon LCM contenant 0 % de glycérol et 0,043 % d'éthanol Beamer capto au culot cellulaire, puis pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour resuspendre le culot.Veillez à dissocier tous les agrégats si nécessaire. Vortexez le tube pour rompre tout culot cellulaire non dissous. Ensuite, pour extraire les membranes cellulaires et virales, ajoutez 1,5 millilitre.Agitez vigoureusement immédiatement dans un vortex. Faites centrifuger 10 minutes à 2000 RCF à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, deux couches apparaîtront.La couche supérieure aqueuse contient les nucléocapsides virales et les protéines, tandis que la couche inférieure de Fréon contient les membranes virales et cellulaires. À l’aide d’une pipette à embout large, prélevez la couche supérieure en évitant l’interface, puis transférez-la dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Il est important d’éviter tout contact avec la couche de Fréon et de ne pas entraîner ce solvant organique dans la couche aqueuse du nouveau tube.Ajouter du freon et vortexer comme précédemment afin de répéter l'extraction au freon après centrifugation. Recueillir la couche supérieure d'environ cinq millilitres et transférer dans un tube neuf en polyéthylène pour ultracentrifugeuse. Ajouter du Beamr Capto éthanol à 0,043 % aux deux tampons LCM glycérol restants.Ensuite, pour préparer un gradient dans le tube de centrifugeuse en polymère, utilisez une pipette fine pour déposer sous la couche d'extrait de Fréon trois millilitres de LCM contenant 5 % de glycérol. Superposez ensuite 2,5 millilitres de LCM contenant 45 % de glycérol sous cette couche. En outre, si nécessaire, préparez un tube témoin équivalent en utilisant les mêmes proportions de tampons LCM.Placer les tubes dans des godets d'ultracentrifugeuse et les équilibrer à 0,1 gramme près en ajoutant délicatement du tampon LCM contenant 0 % de glycérol dans la couche supérieure, par ajouts de 50 à 100 microlitres à la fois. Faire tourner les échantillons équilibrés pendant une heure à 77 000 RCF et à quatre degrés Celsius lors de l'ultracentrifugation. Utiliser une pipette en verre munie d'un embout en forme de crochet pour récupérer l'ADN flottant lors de l'étape de précipitation à l'éthanol.Tenez les deux extrémités de la pipette et suspendez la section centrale au-dessus de la flamme. Lorsqu'une section du verre est tiède, tirez doucement pour étirer le verre. Courbez-la délicatement afin de former un crochet fortement angulé, inférieur à 90 degrés, puis tirez brusquement pour sceller l'extrémité.Si l'extrémité du crochet en verre est ouverte, maintenez l'extrémité au-dessus des flammes afin que le verre fonde suffisamment pour se refermer. Après l'ultracentrifugation, un petit culot mince et opaque apparaîtra, avec une tache foncée au centre, contenant les nucléocapsides virales. Aspirez délicatement le liquide du tube, y compris les gouttelettes le long des parois, mais en évitant le culot au fond du tube.Ajouter 0,5 millilitres de TNE à température ambiante. Laisser le culot reposer pendant au moins 10 minutes afin de permettre son hydratation. Si la procédure n'est pas poursuivie le jour même, placer le culot en suspension à quatre degrés Celsius.À l’aide d’une pipette P200, dispersez le culot hydraté en aspirant et en expulsant plusieurs fois. Ne vous inquiétez pas de la fragmentation à cette étape, car l’ADN viral est encore contenu dans les capsides. Pour rompre les capsides, ajoutez au culot viral 4,25 millilitres de TNE, 0,25 millilitre de SDS à 10 % et deux milligrammes de protéine EK à température ambiante.Agiter doucement pour mélanger ces réactifs. Une légère augmentation de la viscosité doit maintenant être observée maintenant que les capsides ont été détruites. Il convient de faire attention à ne pas cisailler l'ADN : utiliser des pipettes à embout large et ne pas vortexer le matériel viral afin d'extraire les protéines virales.Transférez l'échantillon dans un tube contenant un gel de verrouillage de phase et ajoutez cinq millilitres de phénol-chloroforme. Commencez immédiatement à retourner le tube afin de maintenir un mélange émulsionné par inversion, pendant au moins 10 secondes. Ensuite, centrifugez l'émulsion pendant cinq minutes à 2000 RCF à température ambiante.Après la centrifugation, prélevez la couche supérieure et transférez-la dans un nouveau tube à gel verrouillé par phase. Répétez l'extraction au phénol-chloroforme, puis centrifugez à nouveau après la deuxième extraction au phénol-chloroforme. Récupérez la couche supérieure dans un tube en verre Coex de 30 millilitres et placez le tube à refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes.Veiller à ce qu'il ne gèle pas. Ajouter 10 millilitres d'éthanol froid. Filmer le tube et le retourner pour mélanger.Observer immédiatement l'apparition d'un fantôme d'ADN, qui se présente sous la forme d'un précipité fin et filamenteux. Retourner délicatement le tube pour favoriser un mélange supplémentaire et provoquer l'agglutination des précipités d'ADN collants. Enfin, utiliser un crochet en verre pour extraire soigneusement les fantômes d'ADN, puis éponger l'ADN en le tamponnant avec un essuie-tout afin d'éliminer l'excès de liquide.Ensuite, placez la pointe du crochet vers le bas dans un tube de 1,5 millilitre. Pour maximiser le rendement en ADN, cassez le crochet en verre dans le tube de 1,5 millilitre afin que la suspension de ressuage des fragments de verre puisse se poursuivre au fil du temps. Laissez sécher, puis ajoutez 0,25 à 0,5 millilitre de TE pour dissoudre le fantôme d'ADN.Laisser la reprise en suspension de l'ADN se poursuivre pendant au moins une heure et conserver l'ADN à quatre degrés Celsius. L'ADN viral a été préparé à partir de capsides nucléaires comme décrit dans cet article vidéo ; ci-dessous un exemple représentatif d'un « fantôme » d'ADN bien formé et abondant, composé d'ADN génomique viral linéaire précipité en solution. Les brins s'agrègent et nécessiteront un certain temps pour se réhydrater une fois placés dans une solution aqueuse. L'ADN viral préparé à partir de souches de PRV (Becker, Bartha) et de quatre souches supplémentaires a été électrophorésé pendant une heure sur un gel d'agarose à 0,5 % et coloré au bromure d'athénium.Chaque échantillon de PRV utilise un microlitre d'une préparation de nucléocapside d'ADN viral pour un volume total de 250 microlitres sur la gauche. Une échelle d'ADN provenant du bactériophage lambda. L'ADN digéré montre la grande taille de l'ADN non digéré de lambda de 48,5 paires de kilobases et de l'ADN génomique de PRV d'environ 140 paires de kilobases.Ensuite, une série de dilutions de quantités connues d'ADN Lambda montre que la concentration des échantillons de PRV à droite varie de 50 à 200 nanogrammes par microlitre, pour un rendement total de 12 à 50 microgrammes par préparation virale. Des échantillons d'ADN viral préparés à partir de quatre souches de PRV ont été digérés toute la nuit avec soit BAM H un soit KPN un. Les échantillons d'ADN digérés par les enzymes de restriction ont été séparés par électrophorèse nocturne sur un gel d'agarose à 0,8 % et colorés à l'ethidium bromure bam.Les pistes H un contiennent huit microgrammes de nucléocapside virale, ADN, tandis que les pistes KPN un contiennent quatre microgrammes d'ADN viral. Chaque souche différente de PRV peut être distinguée par son profil propre de polymorphisme de la longueur des fragments de restriction. À la suite de cette procédure, d'autres méthodes, telles que le séquençage profond, peuvent être réalisées afin d'obtenir des données sur le contenu du génome viral après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie pour caractériser l'ADN viral par polymorphisme de la longueur des fragments de restriction ou R fps, transfert Southern, clonage, construction de virus recombinants en ADN, et d'autres manipulations des herpèsvirus et d'autres types de virus.N'oubliez pas que le travail avec le fon peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que travailler sous une hotte aspirante, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Après la centrifugation, la couche de fon peut passer rapidement d'un état semi-solide gélatineux à un liquide, donc chaque tube doit être évalué individuellement avant de décider si le versement ou le pipetage constitue la meilleure méthode pour récupérer la couche aqueuse supérieure.

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