Marquage rétrograde des motoneurones de la drosophile à l’aide de colorants lipophiles fluorescents

Commence avec un embryon de drosophile disséqué fixé sur une lame de verre entourée de ruban adhésif.

Les motoneurones de la mouche sont marqués par fluorescence pour la visualisation.

À l’aide d’un microscope, visualisez l’embryon et positionnez une micropipette remplie de colorant lipophile fluorescent vert près de l’embryon.

Ensuite, passez en mode fluorescence et localisez l’extrémité axonale du motoneurone à la jonction neuromusculaire, là où le motoneurone se connecte au muscle.

Passez en mode fond clair, contactez l’extrémité de l’axone cible avec la pipette, libérez une goutte de colorant, puis incuberez.

En raison de leur nature lipophile et de leur voisinage axonal, les colorants pénètrent sélectivement dans la membrane riche en lipides de l’axone ciblé.

Au fil du temps, le colorant se déplace rétrogradement, se déplaçant vers l’arrière le long de la bicouche lipidique axonale vers le corps neuronal, étiquetant les projections neuronales.

Retirez le ruban de la lame et placez une lamelle.

Observez la lame sous un microscope confocal.

Le neurone cible marqué rétrograde apparaît en fluorescence verte, affichant une morphologie neuronale et des projections détaillées.

À l’aide d’une aiguille de verre placée sous un microscope à dissection, faites sortir l’embryon de la membrane vitelline du ruban adhésif sur le verre, en prenant soin de ne pas endommager les tissus internes de l’embryon. Ensuite, coupez la ligne médiane d’un seul embryon à sa surface, de son extrémité postérieure à son extrémité antérieure. Retournez les tissus épithéliaux à partir du centre et fixez le bord de l’épiderme sur la surface de la lame de verre.

Utilisez une aiguille reliée à un tube avec une ouverture d’extrémité d’environ 300 micromètres pour aspirer ou souffler de l’air afin d’enlever les troncs trachéaux longitudinaux dorsaux, ainsi que les intestins restants. Utilisez 4 % de PFA et de PBS pour fixer les embryons pendant 5 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital. Ensuite, lavez-les trois fois avec du PBS.

Colorez les embryons avec 1 microlitre d’anticorps anti-raifort peroxydase conjugué à de la cyanine 3 colorant et 200 microlitres de PBS pendant une heure sur l’agitateur orbitaire. Et répétez les lavages dans PBS. Pour remplir la micropipette d’injection, placez-la dans le support capillaire. Ensuite, placez la lame de colorant sur la scène et utilisez le micromanipulateur pour la positionner sur la lame.

Ajustez ensuite la platine pour placer la micropipette sur le colorant. Récupérez le colorant et la micropipette en réglant la pression d’injection entre 200 et 500 hectopascals, le temps d’injection entre 0,1 et 0,5 seconde et la pression de compensation à 0 pendant 5 minutes. Une fois le colorant prélevé, retirez la lame de colorant et placez l’échantillon sur la platine du microscope.

Augmentez ensuite la pression de compensation jusqu’à une plage de 30 à 60 hectopascals et abaissez la micropipette dans l’échantillon. Utilisez la lentille 10 fois objectif pour localiser l’embryon et aligner la micropipette avec l’embryon. Changez la lentille de l’objectif pour une lentille à immersion dans l’eau 40 fois et immergez la lentille dans le PBS.

Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l’anti-HRP Cy3 et déterminer le site d’injection. Lorsque l’embryon est focalisé, changez la position de la micropipette pour établir un contact doux avec l’extrémité de l’axone d’intérêt. Utilisez ensuite la microscopie à fond clair pendant l’injection pour voir la gouttelette de colorant. Déposez le colorant dans un hémisegment abdominal droit à la jonction neuromusculaire de l’ACC ou du RP3 avec DiD ou DiO.

Utilisez la commande manuelle pour libérer le colorant et retirer la micropipette. Passez ensuite au site d’injection suivant. Incuber l’échantillon pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital avant l’imagerie. À l’aide d’une pince fine, retirez les rubans de la lame de verre.

Pour monter l’échantillon, préparez une lamelle avec une petite quantité de graisse sous vide aux quatre coins. Placez-le soigneusement sur l’échantillon, en veillant à éviter les bulles d’air. Appuyez sur la lamelle pour ajuster l’espace par rapport à l’échantillon afin de permettre une distance de travail entre l’objectif et la lame.

Retirez tout excès de PBS avec des lingettes de travail. Scellez complètement les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Imagez à 10 fois et 100 fois avec un microscope confocal et traitez les images avec le logiciel ImageJ.