Imagerie de l’activation neuronale de l’hippocampe dans des sections de cerveau de souris

Commencez par des sections de cerveau de souris exposant l’hippocampe dorsal, riche en neurones.

Ajoutez du peroxyde d’hydrogène pour éteindre l’activité de la peroxydase neuronale, suivi d’un lavage.

Traitez avec un tampon de perméabilisation, puis appliquez un tampon de blocage pour bloquer la liaison non spécifique.

Ajouter les anticorps primaires et incuber avec agitation. Ces anticorps se lient aux protéines marqueurs d’activation neuronale.

Laver et appliquer des anticorps secondaires conjugués à la biotine pour lier les anticorps primaires.

Rincez et introduisez un complexe avidine-biotine-peroxydase qui se lie à la biotine sur les conjugués.

Lavez à nouveau, puis ajoutez un substrat chromogène, qui est oxydé par la peroxydase pour générer un précipité brun. Arrêtez la réaction avec PBS.

Transférez les sections sur une lame recouverte de gélatine et déshydratez-les en utilisant des concentrations croissantes d’éthanol. Ensuite, nettoyez les sections en xylène et montez-les.

Place la lame sous un microscope à fond clair.

Sous éclairage lumineux, les régions non colorées transmettent la lumière et apparaissent brillantes, tandis que les neurones colorés absorbent et réfléchissent la lumière et apparaissent plus sombres.

La zone plus sombre distincte indique une activation neuronale dans l’hippocampe.

Transférez trois à cinq sections dorsales de l’hippocampe pour chaque souris dans les puits d’une plaque de 24 multi-puits contenant 500 microlitres de PBS 0,1 molaire pour chaque puits. Lavez les sections contenues dans chaque puits avec 500 microlitres de PBS 0,1 molaire. Effectuez tous les lavages et incubations à température ambiante en agitant doucement, sauf indication contraire. Sous une hotte, incubez les sections dans du méthanol à 40 %, du peroxyde d’hydrogène à 1 % dans du PBS à 0,1 molaire pendant 20 minutes afin d’éteindre l’activité de la peroxydase endogène.

Après trois autres lavages dans du PBS 0,1 molaire, perméabilisez les sections en les incubant dans 500 microlitres de Triton X-100 à 0,2 % pendant cinq minutes. Pendant que les sections sont en incubation, préparez suffisamment de tampon de blocage pour l’ensemble de l’expérience. Ensuite, retirez la solution de perméabilisation et ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage dans chaque puits. Incuber les sections pendant une heure.

Ensuite, retirez le tampon de blocage et recouvrez les sections d’anticorps primaire kinase régulé extracellulaire phosphorylé, dilué de 1 à 500 dans un tampon de blocage. Incuber les sections pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec une légère agitation. Le lendemain, après avoir lavé les sections trois fois dans du PBS 0,1 molaire pendant 5 minutes chacune, incubez les sections avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine dilué 1 à 250 tampon bloquant pendant une heure à température ambiante.

Pendant l’incubation, préparez le réactif ABC au moins 30 minutes avant l’utilisation afin de laisser suffisamment de temps pour que le complexe avidine et biotine se forme. Après avoir lavé les sections trois fois de plus avec du PBS 0,1 molaire, ajoutez le réactif ABC et laissez-le incuber avec l’échantillon pendant 45 minutes. Au cours de la prochaine série de trois lavages dans PBS, préparez la solution de travail du tampon dans la hotte selon les spécifications du fabricant. Aliquote la solution de travail du dab dans la plaque.

Ensuite, transférez les sections dans les puits contenant la solution de travail DAB et faites tourner lentement la plaque pour permettre une exposition maximale des sections à la solution. Surveillez la réaction DAB sur un microscope jusqu’à ce qu’un signal adéquat se développe dans environ deux à cinq minutes. Arrêtez la réaction à l’intensité de couleur souhaitée en lavant le tissu dans du PBS à 0,1 molaire. Après trois autres lavages en PBS, montez les sections sur des lames enduites de gélatine et séchez-les à température ambiante pendant au moins trois à quatre heures.

Une fois séchées à l’air, transférez les lames dans la hotte et déshydratez les sections en les plaçant séquentiellement dans des solutions d’éthanol classées pendant deux minutes chacune. Ensuite, effacez les lames dans 100 % de xylènes pendant cinq minutes. Lissez les lames à l’aide d’un support de montage et laissez-les sécher dans la hotte pendant la nuit.

Transférez les lames sur un microscope à fond clair équipé d’une caméra dans un objectif 20x. Acquérez plusieurs images en fond clair de chaque section à un grossissement de 200x, couvrant l’hippocampe dorsal. Imagez de trois à cinq sections de chaque animal.