Imagerie de la dynamique intracellulaire de l’ATP à l’aide de capteurs basés sur FRET dans une tranche d’hippocampe de souris organotypique

Sécurisez une tranche d’hippocampe de souris organotypique dans une chambre expérimentale.

La tranche contient des neurones et des astrocytes transduits exprimant un capteur ATP avec des protéines fluorescentes donneuses et accepteuses.

Place la chambre sur une platine de microscope à fluorescence et perfuse-la avec de l’ACSF oxygéné.

Permet à la tranche de s’adapter aux conditions tamponnées.

À l’aide de la lumière de transmission, concentrez la tranche et identifiez la zone d’intérêt.

Passez en mode fluorescence et excitez la protéine fluorescente donneuse pour initier l’émission de fluorescence.

Lors de la liaison ATP, le capteur subit des changements de conformation, permettant le transfert d’énergie basé sur la fluorescence du donneur à l’accepteur, qui émet de la fluorescence à une longueur d’onde plus longue.

Utilisez un miroir dichroïque et des filtres passe-bande pour isoler et séparer les émissions du donneur et de l’accepteur.

Sélectionnez une région sans fluorescence pour la soustraction de l’arrière-plan. Ensuite, identifiez les cellules cibles et enregistrez leur fluorescence au fil du temps.

Calcule le rapport FRET pour surveiller les niveaux d’ATP intracellulaires en temps r