Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de la souris

Prenez une souris transgénique anesthésiée avec la tête fixée à un angle sur un support pour l’imagerie in vivo de la rétine de la souris.

La rétine contient des cellules ganglionnaires rétiniennes, ou RGC, exprimant une protéine marquée au fluorophore.

Appliquez du lubrifiant pour les yeux et montez une lamelle sur l’œil.

Sous un microscope, éclairer uniformément la rétine pour exciter les protéines fluorescentes dans les CGR.

En utilisant la fluorescence émise, obtenez une vue à grand champ des RGC du plan focal et des RGC flous.

Passez en mode d’imagerie à deux photons, en concentrant la lumière proche infrarouge de faible énergie dans la couche RGC.

Au point focal, l’énergie combinée de deux photons excite le fluorophore, qui libère ensuite de l’énergie sous forme de fluorescence.

Comme l’excitation est confinée à un seul point, la fluorescence des autres plans focaux est minimisée.

Capturez des images à plusieurs plans focaux le long de l’axe z pour imager l’ensemble de la couche RGC.

Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes sur les deux yeux de la souris. Tournez le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la pupille d’un œil soit orientée dans l’alignement du trajet de la lumière, et placez une lamelle numéro 1,5 dans le porte-filtre compact. Après avoir fixé le support à la platine du microscope, abaissez la lamelle jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le lubrifiant i-gel sans toucher la cornée. Et ajustez la platine dans la dimension xy et la position z de l’objectif jusqu’à ce que la lumière d’excitation à champ large recouvre complètement la cornée.

Utilisez l’oculaire pour continuer à ajuster la position z, jusqu’à ce que les cellules ou les structures fluorescentes de la rétine deviennent nettes, en augmentant l’illuminateur d’épifluorescence si nécessaire pour résoudre les cellules ou les structures d’intérêt individuelles. Affinez l’alignement de la rétine avec le trajet de la lumière d’imagerie. Ajustez l’angle de la tête jusqu’à ce qu’il n’y ait qu’une expansion ou une contraction de la lumière floue lors du changement de plan focal, minimisant ainsi les distorsions xy.

Éteignez ensuite l’illuminateur d’épifluorescence et fermez l’obturateur de l’illuminateur. Pour l’imagerie à deux photons, suivez tous les protocoles de sécurité laser de l’établissement. Éteignez et couvrez toute la lumière ambiante et basculez le chemin de la lumière d’excitation sur le laser et le chemin de la lumière d’émission sur les PMT.

Dans le logiciel d’acquisition d’images, réglez la taille de l’image sur 512 par 512 et la moyenne de l’image sur 3. Réglez le z-step pour qu’il commence en haut de la pile et progresse vers le bas, en minimisant l’activation laser à deux photons des photorécepteurs. Allumez et activez les PMT, puis ajustez la tension à 680 volts.

Activez les obturateurs d’imagerie et d’émission. Commencez un aperçu en direct du tissu cible à partir d’une puissance laser de 1 % et ajustez automatiquement la luminosité de l’écran pour visualiser les cellules ou les structures d’intérêt. Si le tissu cible est sombre ou peu clair, augmentez le pourcentage de puissance laser jusqu’à ce que les structures deviennent visibles sans dépasser 45 milliwatts.

Manœuvrez la platine du microscope dans la direction xy pour la centrer sur une zone d’imagerie souhaitée, puis naviguez vers le plan z, avec les structures d’intérêt au point. Pour une expérience de time-lapse chronique, ouvrez une image précédemment obtenue à utiliser comme référence pour les cellules d’intérêt, en veillant à ce que l’angle d’imagerie de l’image actuelle soit similaire à celui des images précédentes. Naviguez ensuite vers les plans z supérieur et inférieur d’intérêt pour définir les limites z de la pile d’imagerie et acquérir l’image.