Imagerie par fluorescence de la dynamique neuro-immune à l’aide d’un implant crânien

Commencez avec une souris transgénique anesthésiée avec une fenêtre d’imagerie circulaire en verre et une plaque frontale implantée sur son crâne.

Les cellules microgliales ou immunitaires et les neurones sont marqués avec des protéines fluorescentes.

Ensuite, fixez la souris sur la platine du microscope à deux photons.

Ensuite, injectez un colorant fluorescent intrapéritonéally pour colorer les vaisseaux sanguins en rouge.

Nettoyez la fenêtre d’imagerie en verre, appliquez une goutte saline et abaissez l’objectif du microscope.

Ensuite, réglez la lumière laser pour capturer une image des vaisseaux sanguins. Enregistrez le motif de ramification et les coordonnées pour localiser et imager la même région plus tard.

Maintenant, réglez le laser pour qu’il excite les protéines fluorescentes, provoquant la fluorescence de la microglie et des neurones.

À l’aide du motif de ramification enregistré, localisez la même région et capturez régulièrement des images des cellules.

Le réseau vasculaire et les neurones restent stables, tandis que les changements de position microgliale au fil du temps reflètent la dynamique immunitaire en réponse à l’activité neuronale.

Percez une ouverture circulaire d’environ 4 millimètres dans le crâne à l’aide d’un foret dentaire. Pendant le forage, humidifiez régulièrement le crâne avec une solution saline stérile et des cotons-tiges pour refroidir le cerveau. Enlevez les débris osseux et ramollissez l’os du crâne.

Lorsque vous avez terminé, retirez soigneusement cette partie du crâne à l’aide d’une pince pointue. Une fois le crâne retiré, placez soigneusement un petit verre de couverture imbibé de solution saline dans la craniotomie. Séchez l’excès de solution saline à l’aide d’une lingette stérile. À l’aide d’un applicateur pointu, appliquez de la colle cyanoacrylate autour de la fenêtre et laissez-la se fixer au cerveau et au crâne.

Appliquez la colle primaire sur le reste du crâne et durcissez-le avec une lampe à polymériser pendant 20 à 40 secondes. Créez un puits autour de la fenêtre avec la colle finale et durcissez-le avec une lampe à polymériser pendant 20 à 40 secondes. Collez une petite plaque de tête sur le crâne sur l’hémisphère controlatéral de la craniotomie avec la colle d’amorçage, puis, avec la colle finale, durcissez les deux pendant 20 à 40 secondes.

Après le réveil de la souris, injectez une dose sous-cutanée de buprénorphine SR comme analgésie postopératoire, qui sera suffisante pendant 72 heures. Fournissez à la souris une nourriture extra molle pour faciliter une récupération saine. L’imagerie peut être réalisée dès deux semaines après la chirurgie d’implantation. Utilisez des vis pour monter la plaque de tête sur la platine du microscope à deux photons, qui doit être maintenue à 35 degrés Celsius avec une plaque chauffante.

Injectez à la souris par voie sous-cutanée 100 microlitres de colorant pour vaisseaux sanguins, tel que la rhodamine B. Nettoyez doucement la surface de la fenêtre crânienne avec un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %. Mettez quelques gouttes d’eau ou de solution saline sur la fenêtre et abaissez la lentille de l’objectif dans la solution. Assurez-vous que le laser est éteint lorsque l’objectif s’abaisse.

Dessinez à la main une carte de parcours pour indiquer les principaux points de repère des vaisseaux sanguins, tout en regardant à travers l’oculaire. Utilisez ce dessin pour identifier les régions spécifiques lors de l’imagerie à deux photons. Collectez des images de cellules et de vaisseaux fluorescents à l’aide de l’imagerie à deux photons. Voir le manuscrit pour les paramètres d’imagerie. Prenez des notes minutieuses avec les coordonnées appropriées pour vous assurer que les régions précises peuvent être revisitées pour l’imagerie ultérieure.

Collectez plusieurs champs de vision lors de cette première session d’imagerie.