Imagerie par fluorescence de la dynamique calcique au niveau des jonctions neuromusculaires du diaphragme d’une souris transgénique

Commencez par une configuration de microscope à fluorescence contenant un diaphragme immobilisé avec des nerfs phréniques provenant d’une souris transgénique.

La jonction neuromusculaire du diaphragme se compose d’un motoneurone, d’une fibre musculaire et de cellules de Schwann contenant des récepteurs de l’acétylcholine et des canaux calciques.

Ces cellules ont des récepteurs d’acétylcholine marqués par fluorescence et expriment des indicateurs de calcium intracellulaires.

Un séparateur d’image fixé à la configuration permet de visualiser simultanément les deux signaux fluorescents.

Le nerf phrénique est positionné dans une électrode d’aspiration pour délivrer un stimulus électrique.

Au microscope à fluorescence, visualisez les récepteurs de l’acétylcholine pour identifier une jonction neuromusculaire.

Pour définir une fluorescence de base maximale, ajoutez une solution de chlorure de potassium pour dépolariser temporairement la membrane cellulaire. Cela déclenche un afflux de calcium intracellulaire, provoquant une augmentation de la fluorescence des indicateurs.

Ajustez les paramètres de luminosité pour éviter la sursaturation du signal de fluorescence.

Après la repolarisation, appliquez des stimulations électriques pour déclencher l’afflux de calcium dans la cellule et enregistrez le changement de fluorescence intracellulaire à une fréquence d’images élevée.

À un grossissement de 20 fois, localisez la bande terminale au centre du muscle en recherchant des jonctions neuromusculaires d’alpha-bungarotoxine marquées par fluorescence sous excitation de lumière jaune verte. Passez à l’excitation par la lumière bleue pour imager les réponses calciques dans les muscles, les motoneurones ou les cellules de Schwann. Dans cet exemple, GCaMP 3 est exprimé dans les cellules musculaires.

Si vous le souhaitez, configurez le séparateur d’image avec des filtres passe-bande et un filtre dichroïque à bord unique pour l’imagerie à double longueur d’onde. Effectuez des expériences avec la barre de luminosité de la barre de la table de correspondance, réglée à 110 % du niveau auquel l’indicateur de calcium génétiquement codé exprimant le tissu présente une saturation à un grossissement de 20 fois, sans compartimentation en réponse au chlorure de potassium.

Enregistrez à 20 images par seconde pour ne manquer aucun événement rapide. Stimulez avec 1 à 45 secondes de stimulation nerveuse de 20 à 40 hertz en délivrant une série d’impulsions à l’aide d’une électrode d’aspiration. Et collectez des réponses calciques fluorescentes dynamiques dans un sous-type de cellule, ainsi que le signal de jonction neuromusculaire de l’alpha-bungarotoxine marqué par fluorescence statique