Imagerie bicolore de diffusion Raman stimulée du tissu cérébral de souris

Prenez une tranche de cerveau de souris à l’intérieur d’une chambre sur une lame et placez-la sous un microscope avec un système d’imagerie à diffusion Raman stimulée, ou SRS.

Focalisez deux faisceaux laser synchronisés, connus sous le nom de faisceaux de pompe et de Stokes, sur le tissu.

La différence d’énergie entre ces faisceaux correspond à la fréquence vibratoire de molécules spécifiques, induisant des vibrations moléculaires.

Excitez les lipides et les protéines tissulaires, en ayant des vibrations moléculaires uniques, en utilisant des paires de fréquences distinctes des faisceaux synchronisés.

L’excitation facilite le transfert d’énergie entre les faisceaux, réduisant l’intensité du faisceau de pompe tout en augmentant l’intensité du faisceau de Stokes.

Le changement d’intensité relative est détecté comme un signal SRS qui aide à identifier les molécules.

Un photodétecteur collecte les signaux SRS combinés de l’échantillon.

Attribuez des couleurs distinctes aux signaux lipidiques et protéiques, créant ainsi une image bicolore, afin d’identifier les protéines et les lipides dans le tissu cérébral.

Placez un échantillonneur de faisceau dans la trajectoire du faisceau stokes pour capter 10 % du faisceau. Et envoyez-le à une photodiode rapide pour détecter le train d’impulsions de 8 mégahertz. Prenez l’une des sorties du tampon de fanout et filtrez-la avec un filtre passe-bande pour obtenir l’onde sinusoïdale de 20 mégahertz. Ensuite, utilisez un atténuateur RF pour ajuster la tension d’entrée/sortie crête à crête à environ 500 millivolts. Envoyez la sortie résultante à un déphaseur, ce qui permet un réglage précis de la phase RF avec une source de tension.

Envoyez cette sortie à un amplificateur de puissance RF et connectez la sortie de l’amplificateur à l’EOM. Après avoir débloqué le faisceau stokes, optimisez la profondeur de modulation de la première EOM en plaçant une photodiode dans le trajet du faisceau. Ajustez la tension EOM et la plaque quart d’onde jusqu’à ce que la profondeur de modulation semble satisfaisante. Placez une photodiode après le miroir dichroïque pour détecter le faisceau laser. Bloquez d’abord le faisceau de stokes. Ensuite, zoomez sur l’un des pics d’impulsion de la pompe sur l’oscilloscope. Placez un curseur vertical pour marquer la position temporelle de ce pic avec l’oscilloscope.

Maintenant, bloquez le faisceau de la pompe et débloquez le faisceau stokes. Traduisez l’étage de retard pour qu’il corresponde temporairement aux positions de crête sur l’oscilloscope à la position marquée à l’étape précédente en calculant la distance de retard nécessaire pour faire correspondre les deux faisceaux, puis en allongeant la trajectoire du faisceau le plus rapide ou en raccourcissant la trajectoire du faisceau le plus lent.

Ensuite, préparez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO et du ruban adhésif double face comme espaceur pour maintenir l’échantillon entre la lame et une lamelle. Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté lamelle face à l’objectif du microscope et observez l’échantillon depuis l’oculaire sous un éclairage en fond clair. Trouvez le foyer de l’échantillon à la fois sur les couches supérieure et inférieure des bulles d’air à l’interface de la bande de verre. Ensuite, déplacez le focus pour qu’il soit entre les deux couches de la bande.

Ensuite, réglez l’entrée/sortie du faisceau accordable sur 798 nanomètres. En fonction du débit optique du condenseur, ajustez la puissance optique pour qu’elle soit d’environ 40 milliwatts chacun pour la pompe et les faisceaux d’alimentation au foyer de l’objectif. Ouvrez ensuite l’image numérisée dans Matlab et cliquez sur le bouton Focus pour lancer la numérisation. Ajustez le rétroviseur de direction avant le scanner galvo pour centrer le signal DC sur l’affichage du canal 1.

Déplacez l’étage de retard motorisé et observez de près le verrouillage de la sortie affiché sur l’affichage du canal deux. Enfin, ajustez la temporisation pour maximiser l’intensité du signal AC. Ajustez le miroir dichroïque pour centrer le signal SRS sur le canal CA. Ensuite, ajustez la phase de l’amplificateur de verrouillage pour maximiser le signal.

Après avoir monté l’échantillon, glissez-le sur le microscope et ajustez la puissance des deux faisceaux à environ 40 milliwatts chacun à la mise au point de l’échantillon, comme démontré précédemment, image à balayage ouvert de Matlab. Ensuite, trouvez le signal SRS maximal en balayant l’étage de retard correspondant au pic Raman de 2913 centimètres inverses du DMSO.

Acquérez une image SRS correspondant au pic Raman de 2913 centimètres inverses du DMSO. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez une petite zone au centre du cadre. Utilisez la fonction de mesure pour calculer la moyenne et l’écart type des valeurs dans la zone sélectionnée. Pour l’étalonnage de l’axe de fréquence, enregistrez un balayage hyperspectral avec la plage de l’étage de retard couvrant les pics Raman de 2 913 et 2 994 centimètres inverses du DMSO.

Ensuite, enregistrez les positions de platine correspondant à l’ensemble de données hyperspectrales. Effectuez une régression linéaire pour les positions de scène et les décalages Raman à 2 913 et 2 994 centimètres inverses. À l’aide de l’équation de régression linéaire, convertissez les positions de retard en fréquences Raman correspondantes. Pour l’étalonnage de la résolution spectrale, estimez la position de l’étage en fonction de la position précédente avec l’augmentation de la longueur du chemin optique due à l’insertion de tiges. Réalignez le chevauchement spatial du faisceau en raison de la légère déviation du faisceau lors de l’ajout de tiges de verre.

Installez un séparateur de faisceau polarisant, une plaque quart d’onde et une deuxième EOM dans le trajet du faisceau stokes après la première EOM. Débranchez l’entrée du signal vers la deuxième EOM. Ensuite, branchez l’entrée du signal sur la première EOM et allumez-la. Modulez le faisceau stokes au mégahertz en envoyant le faisceau à travers la première EOM. Ajustez l’inclinaison et la position de la première EOM pour vous assurer que le faisceau est centré à travers le cristal EOM. Préparez un échantillon de coupe de tissu avec du ruban adhésif double face, une lame de microscope et un verre de protection.

Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté de la lamelle face à l’objectif du microscope. Pour l’imagerie SRS en mode Epi-mode, installez une plaque demi-onde avant que le faisceau n’entre dans le microscope pour modifier la polarisation du faisceau entrant dans le microscope. Placez un séparateur de faisceau polarisant au-dessus de l’objectif pour permettre au faisceau rétroréfléchi dépolarisé d’atteindre le détecteur.

Ensuite, utilisez une lentille achromatique de 75 et une lentille asphérique millimétrique pour relayer les photons rétrodiffusés de l’ouverture arrière de l’objectif vers le photodétecteur. Montez le détecteur pour collecter la lumière rétrodiffusée dirigée par le séparateur de faisceau polarisant. Installez ensuite un filtre pour empêcher le faisceau modulé de pénétrer dans le détecteur.