Microscopie à deux photons d’astrocytes et de neurones excitateurs dans un tissu hippocampique de souris dégagé

Commencez avec un tissu hippocampique de souris dégagé rendu optiquement transparent en éliminant les lipides. Le tissu est intégré dans un maillage d’hydrogel pour stabiliser les biomolécules et préserver les structures cellulaires.

Le tissu contient des astrocytes exprimant la protéine fluorescente rouge et des neurones excitateurs exprimant la protéine nucléaire verte, permettant une visualisation distincte.

Placez le tissu sur une lame et créez une chambre à l’aide de colle chaude, en laissant un petit espace.

Appliquez une solution d’adaptation de l’indice de réfraction pour hydrater le tissu et éviter les bulles, puis scellez-la avec une lamelle.

Remplissez la chambre avec une solution d’adaptation de l’indice de réfraction pour réduire la diffusion de la lumière et fermer l’espace.

Visualisez le tissu à l’aide d’un microscope à deux photons.

La lumière proche infrarouge excite les protéines fluorescentes rouges et vertes au niveau du plan focal, ce qui permet d’obtenir une imagerie à haute résolution avec un minimum de photodommages. Les émissions de fluorescence sont détectées séparément, révélant clairement la proximité spatiale entre les astrocytes et les noyaux des neurones excitateurs.

Tout d’abord, placez l’échantillon au milieu de la lame. À l’aide de colle chaude, créez des murs sur les bords du toboggan, presque aussi hauts que le tissu. Assurez-vous de laisser un petit espace dans l’un des coins. Lorsque la couche de colle chaude approche de la hauteur de la tranche de cerveau, appliquez une à deux gouttes de la solution d’appariement de l’indice de réfraction sur l’échantillon pour humidifier la surface supérieure et empêcher la formation de bulles.

Pendant que la colle chaude est encore liquide, scellez le dessus avec une lamelle, en le plaçant aussi uniformément que possible. Ensuite, remplissez la chambre avec la solution d’adaptation de l’indice de réfraction. Fermez l’espace avec de la colle chaude. Si les parois de colle chaude dépassent les bords de la glissière, coupez les bords qui s’étendent. Si un objectif à immersion dans l’huile est utilisé pour l’imagerie, ajoutez deux à trois millimètres supplémentaires de colle sur les parois au-dessus de la lamelle pour retenir la solution d’immersion. Après ce protocole, le tissu cérébral sera nettoyé.