Quantification de neurones nouvellement générés dans le tissu cérébral d’un rat à l’aide de la technique du fractionneur optique

Prenez des tranches de cerveau d’hippocampe d’un rat injecté avec de la bromodéoxyuridine, ou BrdU, un analogue nucléosidique de la thymidine.

BrdU s’intègre dans l’ADN pendant la division cellulaire, marquant les neurones nouvellement générés dans le gyrus denté, une région pour la neurogenèse.

Incuber avec un agent oxydant pour inactiver les enzymes peroxydases endogènes.

Traitez avec de l’acide pour dénaturer l’ADN et exposer BrdU, puis neutralisez l’acide.

Incuber avec un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires et une solution bloquante pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Incuber avec des anticorps primaires ciblant BrdU, suivis d’anticorps secondaires marqués à la peroxydase spécifiques aux anticorps primaires.

Introduisez un substrat chromogène et un agent oxydant, permettant à la peroxydase de convertir le substrat en un résidu coloré.

Montez le tissu et contre-colorez avec un colorant liant les acides nucléiques.

Déshydratez le tissu, puis traitez-le pour augmenter la transparence.

Au microscope, identifiez le gyrus denté.

À l’aide de la technique du fractionneur optique, analysez plusieurs plans sur l’épaisseur du tissu pour quantifier les neurones marqués à BrdU.

Lorsque vous êtes prêt à commencer, l’immunomarquage, laissez les sections revenir à température ambiante. Ensuite, utilisez un pinceau pour transférer une section sur cinq d’une série de sections d’hippocampe à des filets de coloration à 25 puits placés dans des boîtes de Pétri remplies de PBS. Il devrait y avoir 8 à 12 sections par hippocampe pour la coloration. Transférez les filets de coloration, contenant les sections, dans des plats en verre assortis, contenant du PBS, et lavez les sections deux fois pendant 10 minutes dans du PBS.

Ensuite, incubez dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 20 minutes. Après le lavage, passez les sections dans trois solutions d’acide chlorhydrique. Ensuite, neutralisez dans 0,1 molaire de tétraborate de sodium à température ambiante pendant 20 minutes.

Après trois incubations de 10 minutes dans des changements de tampon de lavage, transférez les sections dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les sections dans de l’anti-BrdU de souris, diluées de 1 à 100 dans une solution bloquante pendant 48 heures à 4 degrés Celsius.

Après l’incubation de l’anticorps primaire, laver trois fois pendant 10 minutes chacune dans un tampon de lavage, puis incuber pendant 48 heures dans de la peroxydase de raifort, diluée 1 à 10 dans un tampon de lavage. 48 heures plus tard, transférer les sections dans du PBS pendant 10 minutes et répéter l’opération pour un total de cinq lavages. Après le lavage, transférez les sections dans la solution DAB pendant sept minutes. Ensuite, transférez dans une solution DAB contenant 0,02 % de peroxyde d’hydrogène pendant 10 minutes.

Après une série de lavages, montez les sections dans l’ordre numérique sur les lames de microscope. Laisser sécher environ 30 minutes. Ensuite, faites sécher les échantillons à l’air libre en les plaçant dans un support à lames. Ensuite, réhydratez les échantillons pendant 10 minutes dans une boîte de coloration des lames contenant de l’eau distillée.

Ensuite, transférez les lames sur du violet cristallin à 0,02 % dans de l’eau distillée pendant 15 minutes. Après avoir répété la coloration violette cristalline, réhydratez les sections à travers une série d’éthanol. Ensuite, nettoyez les sections de xylène deux fois pendant 15 minutes à chaque fois. Enfin, ajoutez un support de montage à séchage rapide et lamelles sur les lames.

Après 24 heures, les lames peuvent être utilisées pour la microscopie. Commencez par vérifier l’épaisseur du tissu en plaçant d’abord les lames sur la platine motorisée du microscope, puis en ouvrant le logiciel de stéréologie. Délimitez la zone d’intérêt à l’aide d’un objectif à faible grossissement avant de passer à un objectif à immersion dans l’huile 100x.

Ensuite, choisissez un point spécifique dans le cadre comptable, par exemple, une zone adjacente à un coin, et localisez le haut de la section en vous déplaçant le long du plan focal jusqu’à ce qu’une caractéristique de la section apparaisse nette. Enregistrez cette position z comme 0. Ensuite, déplacez le plan focal vers le bas à travers le tissu jusqu’à ce que le dernier niveau z du tissu soit net, puis marquez cette position. L’épaisseur locale du tissu est définie de 0 à cette extrémité et peut être lue sur l’axe z.

Enregistrez l’épaisseur du tissu. L’épaisseur du tissu est mesurée à plusieurs endroits dans la région d’intérêt. La hauteur du dissecteur et des zones de garde, la taille du comptage, la longueur du cadre et le grossissement final sont déterminés dans une étude pilote. Maintenant, vous pouvez commencer à compter les neurones BrdU-positifs, généralement à un grossissement final de 2 000 à 3 000x, en utilisant un objectif à huile 60x ou à huile 100x, et une ouverture numérique élevée.

Identifiez les neurones BrdU-positifs dans chaque trame de comptage, mais ne comptez pas ceux qui touchent la ligne d’exclusion rouge. Comptez les neurones positifs à BrdU qui touchent la ligne d’inclusion verte et ceux qui se trouvent à l’intérieur de la limite du cadre de comptage. Ne comptez les neurones positifs à BrdU que lorsque la caractéristique d’intérêt est clairement reconnue dans la hauteur du dissecteur. Les neurones semi-visibles montrés ici ne sont pas comptés.