Imagerie en direct de l’œil de la chrysalide de la drosophile à l’aide de la microscopie à fluorescence

Commencez par une chrysalide de drosophile transgénique avec un œil exposé.

Placez la chrysalide sur une perle de gelée à l’intérieur d’un cadre en papier hydraté, entourée d’un anneau de gelée.

L’œil de la chrysalide contient des protéines de jonction marquées à la GFP qui mettent en évidence les limites cellulaires dans le neuroépithélium de l’œil en développement.

Appuyez doucement une lamelle sur la région de l’œil de la nymphe.

Au microscope fluorescent, les jonctions marquées GFP deviennent fluorescentes, montrant l’organisation du neuroépithélium.

Prenez des images à intervalles réguliers à différentes profondeurs et traitez-les pour améliorer le contraste et minimiser le bruit de fond.

Alignez ces images avec des intervalles de temps croissants pour suivre le développement du neuroépithélium.

Initialement, les cellules primaires forment des limites autour des amas de cellules photoréceptrices, tandis que les cellules interommatidiennes ou CI s’organisent en une seule couche.

Plus tard, les CI se différencient en cellules secondaires et tertiaires à proximité des photorécepteurs.

Enfin, les CI en excès sont éliminés par la mort cellulaire programmée, formant un réseau hexagonal qui structure l’œil organisé.

À l’aide d’une pince, soulevez et retirez délicatement l’opercule pour exposer la tête de la nymphe. Ensuite, déchirez le côté de la nymphe pour exposer la zone autour d’un œil. Retirez délicatement la chrysalide du ruban adhésif.

Construisez un petit cadre de 15 millimètres carrés à partir de papier buvard et percez un trou de 5 millimètres au milieu. Plongez le cadre dans de l’eau distillée et placez-le au centre d’une lame de microscope. À l’aide d’une seringue de 30 cc, pressez un anneau uniforme de vaseline pour entourer le cadre en papier buvard.

Ensuite, ajoutez une petite perle de vaseline directement sur la lame. Disposez soigneusement la chrysalide sur le côté et soutenez-la avec la perle de vaseline. Placez une lamelle sur le dessus de l’anneau de vaseline de manière à ce qu’il entre en contact avec l’épithélium au-dessus de l’œil. Comprimez doucement la préparation pour sceller la lamelle contre la vaseline et générez une petite surface de contact plane entre la région de la pupille et de l’œil.

Imagez la préparation de la nymphe à l’aide d’un microscope fluorescent. Capturer des coupes en série à travers le domaine apical du neuroépithélium de l’œil dans la région de la jonction adhérente toutes les sept minutes. Utilisez un logiciel de déconvolution approprié pour réduire l’arrière-plan et améliorer le contraste des images de la section série.

Pour chaque fichier de pile z dans le logiciel LAS AF, accédez au panneau Outils, sélectionnez Déconvolution 3D, puis cliquez sur Appliquer. Générez une projection maximale, ou image MP, pour chaque fichier de pile déconvolué. Alignez chaque image MP pour mettre en évidence les comportements cellulaires individuels et réduire les distractions causées par la croissance de l’organisme, à l’aide des algorithmes intégrés de Photoshop CS5.

Dans l’onglet Fichier du menu principal, ouvrez Scripts, puis sélectionnez Charger les fichiers dans la pile. Ensuite, importez les fichiers d’image MP dans le panneau Charger les calques. Assurez-vous que l’option Tenter d’aligner automatiquement les images sources n’est pas sélectionnée, sinon les données de l’image risquent d’être déformées. Une fois que tous les fichiers MP ont été chargés dans le volet des calques, vérifiez que toutes les images sont dans l’ordre chronologique et que le point le plus ancien se trouve en haut de la pile de calques. Faites-les glisser et déposez-les jusqu’à ce qu’ils soient correctement ordonnés si nécessaire.

Sélectionnez ensuite Aligner automatiquement les calques. Choisissez Repositionner et cliquez sur OK.