Imagerie longitudinale à deux photons de neurones marqués par fluorescence dans l’hippocampe d’une souris vivante

Prenons l’exemple d’une souris transgénique anesthésiée exprimant des protéines fluorescentes dans des neurones pyramidaux clairsemés.

La souris est implantée avec une canule d’imagerie sur l’hippocampe dorsal.

Placez la souris sous le microscope à deux photons sur un coussin chauffant, en fixant la plaque de tête de la canule au support pour immobiliser sa tête.

Appliquez une pommade pour prévenir le dessèchement de la cornée.

Nettoyez la canule avec de l’eau déminéralisée et inspectez-la sous un objectif à faible grossissement pour vérifier s’il n’y a pas de débris, de dommages ou de problèmes de fluorescence.

Alignez la canule d’imagerie avec l’axe optique du microscope pour une imagerie précise.

Ensuite, passez à un objectif haute résolution à immersion dans l’eau.

Remplissez la canule avec de l’eau déminéralisée, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air pour éviter la distorsion de l’image.

Effectuez une imagerie longitudinale à deux photons à l’aide de la lumière infrarouge pour exciter sélectivement les fluorophores dans le plan focal, permettant ainsi l’imagerie des tissus profonds.

La canule implantée facilite l’accès répété à l’hippocampe dorsal pour suivre les changements dendritiques au fil du temps.

Placez la souris sous le microscope au-dessus du tapis chauffant et fixez la plaque de tête au support. Appliquez une pommade pour les yeux sur les yeux de l’animal. Nettoyez ensuite la canule d’imagerie à l’aide d’une seringue et d’une aiguille fine pour déposer de l’eau désionisée dans la canule, puis retirez-la avec une pompe à vide.

Utilisez des objectifs à faible grossissement et à longue distance de travail pour vérifier visuellement la canule pour l’eau résiduelle, la saleté, l’intégrité et la présence de fluorescence. Alignez ensuite la canule sur l’axe optique en ajustant les angles des bras du porte-tête.

Passez à un objectif 25x avec une ouverture numérique de 1,0 et une distance de travail de 4 millimètres. Ajoutez ensuite suffisamment d’eau déminéralisée dans la canule pour la remplir et maintenez l’excès d’eau sur le dessus de la canule. Enfin, utilisez l’excitation à deux photons et imagez les signaux fluorescents.