Imagerie calcique des activités des neurones entériques et des cellules gliales dans le plexus myentérique colique d’une souris

Prenez une chambre d’imagerie contenant du tissu du plexus myentérique colique de souris immobilisé, qui abrite des plexus ganglionnaires composés de réseaux de neurones entériques et de cellules gliales.

Ces cellules sont marquées avec un indicateur de calcium qui devient fluorescent lors de la liaison du calcium.

Ensuite, placez la chambre sur une platine de microscope à fluorescence. Perfuser la chambre avec un tampon préchauffé contenant des inhibiteurs pour supprimer les contractions musculaires pendant l’imagerie.

À l’aide d’un microscope, identifiez les régions ganglionnaires saines qui présentent une fluorescence uniforme.

Acquérir des images fluorescentes pour mesurer l’activité de base, fournissant une référence pour les niveaux de calcium intracellulaire.

Perfuser le tissu avec un agoniste du récepteur pour activer les récepteurs neuronaux, ce qui déclenche un afflux de calcium intracellulaire et une augmentation de l’intensité de la fluorescence.

L’activation neuronale stimule indirectement les cellules gliales environnantes, entraînant un afflux de calcium et une augmentation ultérieure de la fluorescence.

Capturez des images fluorescentes en accéléré pour mesurer les changements d’intensité de fluorescence, qui indiquent la dynamique du calcium et l’activité de signalisation dans les neurones et les cellules gliales par rapport aux niveaux de base.

Pendant l’incubation, faites un tampon de Kreb modifié selon les instructions de la partie écrite du protocole, et ajoutez 3 micromolaires de nicardipine et 1 micromolaire de scopolamine pour inhiber les contractions musculaires pendant le calcium 2 et l’imagerie au niveau des dissections de monture entière. Placez la chambre d’enregistrement sous le microscope fluorescent et, à l’aide d’un système de perfusion par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffés, établissez un taux de perfusion continu de 2 à 3 millilitres par minute de 37 degrés Celsius tampon de Kreb. Assurez-vous d’éviter la formation de bulles d’air dans les deux et la conduite d’aspiration reliée à un piège à vide. Faites la mise au point sur le plexus souhaité sous un éclairage en fond clair. Évitez de surexposer les tissus, ce qui pourrait entraîner un photoblanchiment.

Examinez la charge de fluorophore dans les ganglions et sélectionnez des ganglions sains pour l’imagerie. Les ganglions endommagés malsains présenteront une autofluorescence ou une morphologie ponctuée et ne doivent pas être utilisés pour l’imagerie. Une fois qu’un ganglion est sélectionné, déviez le chemin de la lumière vers la caméra et obtenez une image en direct avec un logiciel d’acquisition d’images. Assurez-vous que le ganglion est net et réglez le taux d’acquisition de l’image et les temps d’exposition.

Les taux et les temps d’acquisition des images varient en fonction des événements que les enquêteurs souhaitent consigner. Pour la plupart des expériences, les images sont traditionnellement acquises à 0,5 à 1 hertz pour les cellules gliales, et jusqu’à 2 à 10 hertz pour les neurones, car les transitoires calciques gliaux ne sont pas aussi rapides que les neurones transitoires calciques.

Démarrez l’enregistrement et établissez l’activité physiologique de base du ganglion choisi en l’absence de stimuli expérimentaux pendant 30 secondes. Appliquez ensuite des médicaments d’intérêt préchauffés, tels que des agonistes et des antagonistes des récepteurs, en utilisant le système de perfusion à flux gravitaire à un rythme de 2 à 3 millilitres par minute selon un protocole optimisé pour votre médicament. Arrêtez l’enregistrement et visionnez la vidéo en accéléré de l’expérience.

Sélectionnez soigneusement les régions d’intérêt, ou ROI, à l’aide du logiciel d’analyse d’images approprié.

Enfin, utilisez un logiciel d’imagerie approprié pour normaliser et comparer l’intensité de fluorescence des régions d’intérêt par rapport à sa valeur de référence initiale. Les changements de fluorescence normalisée sont directement proportionnels aux changements de calcium.