Visualisation de la morphologie des astrocytes à l’aide de l’ionophorèse d’un colorant fluorescent dans une tranche de cerveau de souris fixe

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 4:19 min • May 29th, 2025

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Placez une tranche de cerveau de souris fixée chimiquement dans un plat à fond de verre contenant un tampon et fixez-la avec un filet.

Connectez une électrode remplie d’un colorant fluorescent anionique hydrophile à une source de tension.

Insérez une électrode de terre dans le tampon pour terminer le circuit électrique.

À l’aide d’un éclairage en fond clair, avancez l’électrode remplie de colorant vers la tranche.

Passez à l’imagerie infrarouge différentielle par contraste interférentiel pour localiser un astrocyte.

Percez le soma astrocytaire avec l’électrode pour accéder au cytoplasme.

Appliquez un courant électrique pour faire pénétrer le colorant dans le cytoplasme par ionophorèse.

Passez à la microscopie confocale pour surveiller le mouvement du colorant.

Le colorant hydrophile, incapable de traverser la membrane hydrophobe, se diffuse dans le cytoplasme pour remplir le soma et les branches.

Une fois la cellule remplie, arrêtez le courant et retirez l’électrode.

Laissez la membrane astrocytaire se refermer.

Acquérez des images à différents plans Z et reconstruisez-les pour visualiser la morphologie des astrocytes.

Pour le test d’injection de colorant, placez délicatement une tranche de cerveau légèrement fixée dans un plat à fond de verre rempli de PBS 0,1 molaire à température ambiante. Et maintenez la tranche en place avec une harpe platine avec des cordes en nylon.

Connectez l’électrode à une source de tension et placez l’électrode de terre dans le bain contenant la tranche de cerveau. Déplacez l’objectif d’un microscope confocal vers la région cérébrale d’intérêt.

Et abaissez l’électrode dans la solution à l’aide de la lentille d’immersion dans l’eau 10x, en déplaçant l’électrode au centre du champ de vision. Ensuite, sous champ clair, abaissez lentement l’électrode vers la tranche, en vous arrêtant juste au-dessus de la surface.

Pour remplir un astrocyte d’intérêt avec une ionophorèse, utilisez le contraste interférentiel différentiel infrarouge pour identifier les astrocytes avec des somates allongés de forme ovale, d’environ 10 micromètres de diamètre, 40 à 50 micromètres sous la surface de la tranche.

Il s’agit de la couche radiale de l’hippocampe directement sous la couche cellulaire pyramidale. Au fur et à mesure que nous nous déplaçons dans les tissus, nous pouvons voir des vaisseaux sanguins, des neurones, des astrocytes et d’autres types de cellules.

Une fois qu’un astrocyte a été sélectionné, déplacez la cellule vers le centre du champ de vision et abaissez lentement la pointe de l’électrode dans la tranche. Naviguer à travers le tissu jusqu’à ce que l’électrode soit sur le même plan que le corps cellulaire.

Une fois que le corps cellulaire de l’astrocyte est clairement visible et contourné, faites avancer lentement et doucement l’électrode vers l’avant, en déplaçant l’électrode jusqu’à ce que l’extrémité empale le soma de la cellule.

Déplacez lentement la mise au point de l’objectif de haut en bas pour noter si l’électrode se trouve à l’intérieur du soma. Une fois que la pointe de l’électrode est à l’intérieur de la cellule, allumez le stimulateur à 0,5 à 1 volt pour éjecter en continu le courant dans la cellule.

À l’aide du microscope confocal, observez la cellule se remplir, en augmentant le zoom numérique pour visualiser les détails de la cellule et pour vous assurer que l’extrémité de l’électrode est visible à l’intérieur de la cellule si nécessaire.

Attendez environ 15 minutes jusqu’à ce que les branches et les processus les plus fins apparaissent définis, avant de couper la tension et de retirer doucement la pointe de l’électrode de la cellule.

Pour imager la cellule remplie, attendez 15 à 20 minutes que la cellule reprenne sa forme d’origine, avant d’ajuster le réglage du microscope confocal pour vous assurer que les branches et les processus les plus fins apparaissent définis sous l’objectif 40x.

Installez une pile z d’une taille de pas de 0,3 micromètre, en déplaçant l’objectif tout en imageant jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signal de la cellule. Et définissez cette étape comme le haut.

Ensuite, déplacez l’objectif vers le bas, en faisant la mise au point à travers la cellule jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signal. Et définissez cette étape comme le fond.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026