Intégration du cerveau de la drosophile dans une matrice pour l’imagerie en accéléré des neurones de l’horloge circadienne

Commencez avec un couvercle de boîte de Pétri contenant le cerveau larvaire de la drosophile, pré-exposé à un cycle lumière/obscurité. La tranche contient des neurones de l’horloge exprimant des protéines fluorescentes.

Ajoutez un milieu riche en nutriments avec des antibiotiques pour favoriser la survie neuronale et une solution chaude de fibrinogène.

Mélangez doucement la solution pour répartir uniformément le fibrinogène.

Placez une petite quantité de ce mélange sur la lamelle d’une parabole à fond de verre. Ajoutez de

la thrombine pour réagir avec le fibrinogène afin d’induire la formation d’une matrice de fibrine tridimensionnelle.

Transférez le cerveau sur cette matrice, en le positionnant sur le côté antérieur pour aligner les neurones de l’horloge pour l’imagerie.

Pliez la matrice sur le cerveau pour l’ancrer et empêcher tout mouvement.

Ajoutez un milieu riche en nutriments pour inactiver l’activité de la thrombine.

Scellez la boîte avec une membrane perméable aux gaz pour maintenir l’hydratation et la viabilité neuronale.

Effectuez une imagerie de fluorescence en accéléré à des intervalles spécifiques.

Les changements de fluorescence dans les neurones de l’horloge révèlent leur activation et leur inhibition rythmiques, synchronisées avec le cycle lumière/obscurité, reflétant les rythmes circadiens, le cycle d’activité quotidien.

Après avoir transféré le cerveau dans une solution de travail, distribuez le cerveau et le milieu sur le couvercle d’une boîte de Pétri stérile. Ajoutez ensuite 3,5 microlitres de SAM avec des antibiotiques et ajoutez 3,5 microlitres de SAM chaud avec du fibrinogène.

Il est important de maintenir le milieu SAM avec le fibrinogène à 37 degrés tout au long de cette procédure.

Ensuite, mélangez la solution autour du cerveau en pipetant doucement avec la même pointe de pipette et aspirez 2 microlitres de la solution à déposer sur une lamelle pour un plat à fond de verre. Ensuite, ajoutez 0,8 microlitre de thrombine à la gouttelette et mélangez très rapidement pour initialiser la polymérisation, qui apparaîtra blanche. Ensuite, à l’aide d’une pince, vous pouvez saisir doucement le cerveau et le placer sur la matrice de fibrine en polymérisation.

Ajouter la thrombine après que le cerveau a été transféré à la gouttelette. Ce n’est pas recommandé car cela complique beaucoup la procédure.

Orientez le cerveau au besoin et poussez très doucement le cerveau aussi près que possible de la lamelle. Ensuite, choisissez une couche de fibrine polymérisée et pliez-la sur le cerveau, en utilisant de petits mouvements doux qui ne détachent pas la matrice. Continuez à replier des couches de fibrine polymérisée sur le cerveau à partir de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau. Déposez ensuite 20 microlitres de SAM avec des antibiotiques sur le cerveau intégré pour arrêter l’activité de la thrombine. Posez ensuite un morceau de membrane PTFE sur le support et collez les bords de la membrane sur les parties graissées du plat.