Intégration du cerveau de la drosophile dans une matrice pour l’imagerie en accéléré des neurones de l’horloge circadienne
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:08 min • May 29th, 2025
Commencez avec un couvercle de boîte de Pétri contenant le cerveau larvaire de la drosophile, pré-exposé à un cycle lumière/obscurité. La tranche contient des neurones de l’horloge exprimant des protéines fluorescentes.
Ajoutez un milieu riche en nutriments avec des antibiotiques pour favoriser la survie neuronale et une solution chaude de fibrinogène.
Mélangez doucement la solution pour répartir uniformément le fibrinogène.
Placez une petite quantité de ce mélange sur la lamelle d’une parabole à fond de verre. Ajoutez de
la thrombine pour réagir avec le fibrinogène afin d’induire la formation d’une matrice de fibrine tridimensionnelle.
Transférez le cerveau sur cette matrice, en le positionnant sur le côté antérieur pour aligner les neurones de l’horloge pour l’imagerie.
Pliez la matrice sur le cerveau pour l’ancrer et empêcher tout mouvement.
Ajoutez un milieu riche en nutriments pour inactiver l’activité de la thrombine.
Scellez la boîte avec une membrane perméable aux gaz pour maintenir l’hydratation et la viabilité neuronale.
Effectuez une imagerie de fluorescence en accéléré à des intervalles spécifiques.
Les changements de fluorescence dans les neurones de l’horloge révèlent leur activation et leur inhibition rythmiques, synchronisées avec le cycle lumière/obscurité, reflétant les rythmes circadiens, le cycle d’activité quotidien.
Après avoir transféré le cerveau dans une solution de travail, distribuez le cerveau et le milieu sur le couvercle d’une boîte de Pétri stérile. Ajoutez ensuite 3,5 microlitres de SAM avec des antibiotiques et ajoutez 3,5 microlitres de SAM chaud avec du fibrinogène.
Il est important de maintenir le milieu SAM avec le fibrinogène à 37 degrés tout au long de cette procédure.
Ensuite, mélangez la solution autour du cerveau en pipetant doucement avec la même pointe de pipette et aspirez 2 microlitres de la solution à déposer sur une lamelle pour un plat à fond de verre. Ensuite, ajoutez 0,8 microlitre de thrombine à la gouttelette et mélangez très rapidement pour initialiser la polymérisation, qui apparaîtra blanche. Ensuite, à l’aide d’une pince, vous pouvez saisir doucement le cerveau et le placer sur la matrice de fibrine en polymérisation.
Ajouter la thrombine après que le cerveau a été transféré à la gouttelette. Ce n’est pas recommandé car cela complique beaucoup la procédure.
Orientez le cerveau au besoin et poussez très doucement le cerveau aussi près que possible de la lamelle. Ensuite, choisissez une couche de fibrine polymérisée et pliez-la sur le cerveau, en utilisant de petits mouvements doux qui ne détachent pas la matrice. Continuez à replier des couches de fibrine polymérisée sur le cerveau à partir de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau. Déposez ensuite 20 microlitres de SAM avec des antibiotiques sur le cerveau intégré pour arrêter l’activité de la thrombine. Posez ensuite un morceau de membrane PTFE sur le support et collez les bords de la membrane sur les parties graissées du plat.
Aperçu
Cette étude décrit une méthode d'imagerie des neurones horlogers du cerveau de larve de Drosophila utilisant une matrice fibrineuse tridimensionnelle. La technique permet d'observer l'activité neuronale rythmique en réponse aux cycles clair/obscur.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Techniques d'imagerie
Contexte
- Drosophila melanogaster est un organisme modèle pour l'étude des rythmes circadiens.
- Les neurones horloges jouent un rôle crucial dans la régulation des cycles d'activité quotidiens.
- Les protéines fluorescentes permettent la visualisation de l'activité neuronale.
- Les matrices de fibrine fournissent un environnement favorable à la survie neuronale.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour l'inclusion et l'imagerie des neurones du cerveau de Drosophila.
- Observer l'activation rythmique des neurones horlogers.
- Étudier la synchronisation de l'activité neuronale avec les cycles clair/obscur.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une matrice de fibrine à l'aide de thrombine et de fibrinogène.
- Incorporation du cerveau de larve de Drosophila dans la matrice de fibrine.
- Imagerie fluorescente en laps de temps pour surveiller l'activité neuronale.
- Utilisation d'une membrane perméable aux gaz pour maintenir l'hydratation.
Résultats principaux
- Incorporation réussi de neurones horlogers dans une matrice de fibrine.
- Observation de variations rythmiques de la fluorescence en réponse aux cycles clair/obscur.
- Mise en évidence de la viabilité des neurones pendant l'imagerie.
- Apercus sur les rythmes circadiens des neurones horlogers de Drosophila.
Conclusions
- La méthode de la matrice de fibrine est efficace pour l'imagerie de l'activité neuronale.
- Cette approche peut améliorer la compréhension des rythmes circadiens chez Drosophila.
- De futures études pourraient explorer les implications de ces résultats dans des contextes plus larges.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une visualisation directe de l'activité neuronale régulée par l'horloge circadienne dans un modèle génétiquement modifiable, soutenant ainsi la validation de cibles en neuropharmacologie. En stabilisant le tissu cérébral dans une matrice tridimensionnelle perméable, elle autorise l'imagerie longitudinale de la dynamique des neurones de l'horloge en réponse à des stimuli environnementaux contrôlés. Cette approche offre une plateforme reproductible pour évaluer les effets de composés sur les voies circadiennes dès les premières étapes de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées à la modulation des voies circadiennes dans des circuits neuronaux intacts.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en reliant des perturbations génétiques ou pharmacologiques à la rythmicité neuronale en temps réel.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des analyses en aval en préservant la viabilité neuronale et la fonction du marqueur fluorescent.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des échantillons afin d'améliorer la reproductibilité des mesures basées sur la fluorescence entre les expériences.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur les systèmes pertinents pour les maladies en modélisant le dysfonctionnement circadien, un facteur mécanistique dans les troubles du sommeil et les troubles métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Facilite la continuité entre la découverte et la validation préclinique grâce à une préparation tissulaire prête pour l'imagerie et reproductible.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte, où la levée des incertitudes mécanistiques concernant les cibles circadiennes est priorisée avant l'identification de composés candidats.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et l'élucidation des voies en permettant l'observation directe des réponses des neurones de l'horloge aux stimuli lumineux et obscurs.
- Écrans de sélection : Améliore la préparation des tests grâce à un encastrement standardisé qui minimise la dérive tissulaire et préserve l'intégrité du signal pendant l'imagerie en séries temporelles.
- Analyse : Produit des mesures quantitatives de fluorescence dans le temps, permettant des comparaisons statistiques des états d'activation neuronale entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en modélisant un processus biologique conservé, pertinent pour les troubles circadiens humains.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable en neurobiologie circadienne, pouvant être partagée entre les équipes de découverte et précliniques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la modulation de la cible en réduisant l'ambiguïté des dynamiques de réponse neuronale.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des protocoles d'imagerie neuronale entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des données fonctionnelles précoces sur l'activation de la voie circadienne.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des composés ajustée au risque, fondée sur leurs effets sur les rythmes des neurones du noyau horloge.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en neuroanatomie de Drosophila et en microscopie de fluorescence.
- Dépend de l'accès à un équipement contrôlé en température pour la polymérisation du fibrine à 37 °C.
- Exige une standardisation des rapports thrombine/fibrinogène afin d'assurer des propriétés matricielles constantes.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la méthode à d'autres systèmes modèles ou sous-types neuronaux.
- Comprend des limites pratiques, telles que l'opacité de la matrice pouvant affecter la résolution de l'imagerie en profondeur tissulaire.
Foire aux questions en biopharmacie
Imagerie en direct de
Vidéos connexes
0 Vues
Formation circadienne de Drosophila Melanogaster
Vidéos connexes
0 Vues
Applications de l’immobilisation des tissus drosophiles avec caillots de fibrine pour l’imagerie en direct
Vidéos connexes
0 Vues
In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d'imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine
Vidéos connexes
0 Vues
Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture
Vidéos connexes
0 Vues
Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile
Vidéos connexes
0 Vues
Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-
Vidéos connexes
0 Vues
In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo
Vidéos connexes
0 Vues
Préparation du drosophile adulte melanogaster pour l’imagerie cérébrale entière pendant les réponses au comportement et aux stimuli
Vidéos connexes
0 Vues
Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026