Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:41 min • May 29th, 2025
Prenez une culture neuronale d’hippocampe de rat à court terme représentant de jeunes neurones et une culture à long terme représentant des neurones âgés.
Les neurones âgés présentent une densité plus élevée de canaux calciques voltage-dépendants de type L, ou L-VGCC, qui restent ouverts plus longtemps lors de la dépolarisation membranaire.
Incuber à l’aide d’un indicateur de calcium fluorescent qui se diffuse dans les cellules, puis laver pour éliminer tout excès de colorant.
Placez les cultures dans une chambre de perfusion sous un microscope à fluorescence.
Introduire une solution contenant des neurotransmetteurs qui se lient aux récepteurs des neurones, induisant l’afflux d’ions sodium et déclenchant la dépolarisation membranaire.
La dépolarisation active les L-VGCC, permettant l’afflux de calcium dans le cytoplasme.
Dans la culture à long terme, la densité plus élevée et l’ouverture prolongée des L-VGCC entraînent une surcharge en calcium, une caractéristique du vieillissement neuronal.
La liaison du calcium à l’indicateur génère de la fluorescence, les neurones âgés présentant une intensité de fluorescence plus élevée, reflétant une augmentation des niveaux de calcium intracellulaire lors de la stimulation.
Dans cette procédure, incubez les cellules avec Fura2-AM pendant 60 minutes à température ambiante dans l’obscurité, puis transférez les lamelles dans la chambre de perfusion. Après cela, placez la chambre de perfusion avec la lamelle dans le support du microscope inversé. Sélectionnez le champ microscopique et perfuser les cellules en continu avec un HBS préchauffé.
Par la suite, épi-illuminez les cellules à 340 et 380 nanomètres à terme, puis enregistrez la lumière émise à 520 nanomètres toutes les 5 à 10 secondes avec une caméra à fluorescence, qui est filtrée par un miroir dichroïque Fura-2. Pour analyser les images fluorescentes enregistrées. Tout d’abord, ouvrez le fichier d’expérience.
À l’aide du logiciel AquaCosmos, cliquez sur Ratio et sélectionnez la plage de rapports souhaitée. Calculez le rapport pixel par pixel dans les images résultantes afin d’obtenir une séquence d’images de rapport. Soustrayez ensuite l’arrière-plan en ajustant le bouton d’éclairage d’arrière-plan. Après cela, appuyez sur Démarrer le calcul. ensuite, appuyez sur le bouton Séquence de tous les temps et effacez les anciennes ROI.
Pour l’analyse quantitative des cellules individuelles, établissez de nouveaux ROI ou les ROI correspondant aux neurones individuels. Pour représenter graphiquement les enregistrements individuels, exportez les valeurs de fluorescence du rapport correspondant à chaque retour sur investissement vers le programme de laboratoire d’origine en cliquant sur Graphique. Cliquez ensuite sur Calculer et enregistrez le fichier TXT. Après cela, faites le calcul correspondant pour estimer l’ampleur de l’augmentation du rapport de fluorescence en réponse à chaque stimulation.