Imagerie des plaques bêta-amyloïdes dans des coupes de tissus cérébraux par immunomarquage et coloration à la curcumine

Commencer par des coupes cérébrales à partir d’un modèle de souris neurodégénérative.

Incuber avec une solution de blocage complétée par un détergent pour augmenter la perméabilité des tissus et bloquer la liaison non spécifique. Jetez la solution.

Introduire des anticorps primaires ciblant les plaques bêta-amyloïdes. Incuber avec agitation pour que les anticorps interagissent avec les plaques bêta-amyloïdes, puis laver.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués d’un fluorophore rouge et incubez dans l’obscurité pour permettre aux anticorps d’interagir.

Laver pour éliminer les anticorps non liés, suivi d’un lavage à l’alcool.

Ajoutez de la curcumine, qui lie les amyloïdes riches en bêta-feuilles avec une affinité élevée, puis lavez.

Ensuite, traitez avec des concentrations d’alcool croissantes, déshydratant les sections du cerveau. Ajoutez du xylène pour éliminer toute trace de réactifs.

Montez une section sur une lame et observez au microscope à fluorescence.

Utilisez un laser de longueur d’onde de 590 nanomètres pour exciter les fluorophores rouges sur les anticorps secondaires. Capturez l’image.

Passez à un laser de longueur d’onde de 480 nanomètres pour exciter la curcumine, émettant une fluorescence verte.

Superposez les images ; la colocalisation de la fluorescence rouge et verte confirme la présence d’une plaque bêta-amyloïde dans le tissu cérébral.

Pour le marquage d’échantillons sectionnés par cryostat avec des anticorps bêta anti-A, laver les échantillons trois fois avec du PBS frais par lavage dans des puits individuels d’une plaque à 12 puits avant de bloquer toute liaison non spécifique avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS et 0,5 % de Triton x-100 pendant une heure à température ambiante.

À la fin de l’incubation, jetez la solution bloquante et incubez les échantillons avec l’anticorps bêta spécifique A pendant la nuit à 4 degrés Celsius et 150 rotations par minute. Le lendemain matin, laver les sections avec trois lavages de 10 minutes dans du PBS frais par lavage, suivis d’une incubation avec un anticorps secondaire approprié conjugué à un fluorophore rouge pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, laver les sections trois fois avec du PBS suivi d’un lavage avec de l’alcool à 70 %. Après le lavage à l’alcool, incubez les sections avec 10 micromolécules de curcumine pendant 10 minutes à température ambiante, suivies de trois lavages d’alcool à 70 % d’une minute.

Après le dernier lavage, déshydratez les sections avec de l’alcool à 90 % et à 100 % pendant une minute par concentration, et nettoyez les sections deux fois pendant cinq minutes par immersion avec du xylène frais par incubation. Ensuite, montez et imagez les sections comme illustré.