Visualisation tridimensionnelle d’une infection par le virus de la rage dans le tissu cérébral d’une souris

Prenez une section de cerveau épaisse fixe d’une souris infectée par le virus de la rage.

Le virus infecte les neurones et se réplique, ce qui entraîne la présence de protéines virales dans les cellules.

Traiter avec un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires et une solution bloquante pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Incuber avec des anticorps primaires ciblant les protéines virales, suivis d’anticorps secondaires conjugués aux fluorophores qui se lient aux anticorps primaires.

Traiter avec un colorant fluorescent liant l’acide nucléique pour marquer le noyau.

Déshydratez le tissu à des concentrations d’alcool croissantes, puis appliquez une solution éclaircissante pour augmenter la transparence du tissu pour l’imagerie.

Montez la section dans une chambre d’imagerie, remplissez-la de solution éclaircissante et scellez-la.

À l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, imagez le tissu séparément à l’aide des marqueurs fluorescents, puis fusionnez-les pour créer une image bidimensionnelle.

Acquérez des images à différents plans focaux sur le tissu et combinez-les pour générer une représentation tridimensionnelle permettant d’évaluer la progression de l’infection.

Pour l’immunocoloration des coupes de tissu cérébral, laver les échantillons deux fois pendant 1 heure dans 4 millilitres de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS, suivi d’une perméabilisation pendant deux jours à 37 degrés Celsius, dans 4 millilitres de Triton X-100 à 0,2 %, de diméthylsulfoxyde à 20 % et de glycine à 0,3 % dans du PBS. Bloquez toute liaison non spécifique avec 4 millilitres de Triton X-100 à 0,2 %, de diméthylsulfoxyde à 10 % et de sérum normal à 6 % dans du PBS pendant deux jours à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation bloquante, étiquetez les échantillons avec 2 millilitres de solution d’anticorps primaires pendant cinq jours à 37 degrés Celsius, en rafraîchissant la solution d’anticorps après deux jours et demi. Ensuite, lavez les échantillons pendant une journée dans 4 millilitres de Tween 20 à 0,2 % et 10 microgrammes par millilitre d’héparine dans du PBS, en remplaçant le tampon de lavage au moins quatre à cinq fois au cours de la journée et en laissant le lavage final pendant la nuit.

Le lendemain, incubez les échantillons dans 2 millilitres de solution d’anticorps secondaires pendant cinq jours à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les échantillons dans 4 millilitres d’héparine fraîche à 0,2 % Tween 20 et 10 microgrammes par millilitre d’héparine dans du PBS, comme démontré.

Pour la coloration nucléaire des échantillons, incubez les échantillons dans 4 millilitres de colorant d’acide nucléique TO-PRO-3 pendant 5 heures, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les échantillons dans 0,2 % de Tween 20 et 10 microgrammes par millilitre d’héparine dans du PBS comme démontré, suivi d’une déshydratation dans une série ascendante de tert-butanol pendant 2 heures par immersion.

Après l’immersion à 90 %, transférez les échantillons dans une solution de tert-butanol à 96 % pendant la nuit. Le lendemain matin, déshydratez davantage les échantillons dans du tert-butanol à 100 % pendant 2 heures avant d’éliminer les sections de tissu dans du BABB-D15 fraîchement préparé pendant 2 à 6 heures jusqu’à ce qu’ils soient optiquement transparents. Les échantillons peuvent ensuite être stockés dans BABB-D15, à l’abri de la lumière jusqu’à leur montage et leur imagerie.

Pour le montage d’échantillons, utilisez une imprimante 3D pour imprimer une chambre d’imagerie et un couvercle. Montez une lamelle de 30 millimètres de diamètre sur la chambre d’imagerie avec du caoutchouc de silicone vulcanisant à température ambiante à un composant. De même, montez une lamelle de 22 millimètres sur le couvercle. Utilisez un coton-tige imbibé d’eau pour enlever l’excès de caoutchouc de silicone sur les deux anneaux avant de laisser le caoutchouc durcir pendant la nuit.

Le lendemain, placez un échantillon dans la chambre d’imagerie et ajoutez un petit volume de BABB-D15 dans la chambre avant d’insérer le couvercle. À l’aide d’une aiguille hypodermique, remplissez la chambre avec BABB-D15 par l’entrée et bouchez l’entrée avant de sceller la chambre d’imagerie avec du caoutchouc de silicone.

Pour configurer l’acquisition d’image, sélectionnez les lignes laser appropriées pour les fluorophores utilisés et ajustez les plages de détection de chaque détecteur afin d’éviter le chevauchement du signal entre les canaux. Définissez ensuite les paramètres d’acquisition, définissez les bords supérieur et inférieur de la pile et acquérez la pile d’images.

Pour générer des projections 3D de la pile d’images, ouvrez les fichiers d’image dans Fidji et sélectionnez Image, Couleur, Outil Canaux, Plus et Diviser les canaux pour diviser les images fusionnées en canaux individuels. Pour la correction du blanchiment des images pour chaque couche, sélectionnez Image, Ajuster, Correction du blanchiment, puis sélectionnez Rapport simple. Utilisez les curseurs pour régler la luminosité et le contraste de chaque couche, puis sélectionnez Image, Couleur et Fusionner les couches. Cochez l’option Créer un composite.

Convertissez l’image au format RVB et sélectionnez Image, Piles et projet 3D pour générer une projection 3D. Sélectionnez le point le plus lumineux comme méthode de projection et définissez l’espacement des tranches pour qu’il corresponde à la taille du pas Z de la pile d’images acquise. Pour une qualité maximale, réglez l’incrément de l’angle de rotation sur 1 et activez l’interpolation. Modifiez les seuils de rotation totale, de transparence et d’opacité selon vos besoins. Enregistrez ensuite la projection 3D sous les deux noms . formats de fichiers TIFF et .AVI.