Visualisation des projections des motoneurones et de la ramification des axones à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

Prenez un segment de tissu chimiquement fixé et nettoyé d’un embryon de souris transgénique exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) dans les motoneurones de la colonne vertébrale.

Montez le tissu verticalement sur une pointe de pipette modifiée.

Fixez l’extrémité à un capillaire fixé à l’intérieur du microscope à fluorescence à feuillet de lumière.

Placez une chambre d’échantillonnage remplie de tampon sous le tissu pour l’immerger et éliminer les débris.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie, alignez le tissu sur le trajet de la lumière.

La

source lumineuse émet une mince couche de lumière laser, provoquant des GFP dans un seul plan du tissu pour émettre de la fluorescence.

Un détecteur positionné perpendiculairement au trajet de la lumière capte la fluorescence émise.

Acquérir des images des motoneurones de la colonne vertébrale pour générer une reconstruction 3D de la morphologie des branches axonales.

Utilisez un logiciel pour cartographier les axones, identifier les modèles de ramification et les points d’extrémité afin d’évaluer la croissance et la connectivité des motoneurones.

Configurez des optiques d’éclairage 5X/0.1 et des optiques de détection 5X/0.16. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon. Préparez la chambre d’échantillonnage en la remplissant d’une solution éclaircissante. Pour monter l’embryon, préparez une pointe de pipette P200 en coupant la partie supérieure de manière à ce qu’elle s’adapte au diamètre du capillaire, et retirez la partie pointue pour la fixation de l’échantillon.

Ensuite, faites fondre l’extrémité émoussée de la pointe de la pipette à l’aide d’une petite flamme. Éteignez la flamme et fixez rapidement l’embryon verticalement sur l’extrémité fondue. Ajustez la partie supérieure de la pointe de la pipette avec le capillaire de l’échantillon et placez la chambre d’échantillon préparée dans le microscope. À l’aide du logiciel d’imagerie, sélectionnez Localiser capillaire sous l’onglet Localiser et ajustez les axes xy et z.

Ensuite, sélectionnez Localiser l’échantillon et zoomez sur 0,6X pour vous concentrer sur l’embryon. Laissez le tampon de la chambre s’équilibrer avec l’embryon pendant un certain temps pour éliminer tous les débris ou bulles. Pour l’acquisition d’images, sous l’onglet Acquisition, définissez les paramètres du trajet lumineux, tels que les objectifs de détection, le filtre de blocage laser, le séparateur de faisceau, les caméras et les lasers.

Cochez la case du balayage pivot pour la réduction des ombres. Ensuite, définissez les paramètres d’acquisition, profondeur de bits à 16 bits. Zoomez sur la plage comprise entre 0,36 et 0,7X pour un éclairage simple face ou un éclairage double face. Cliquez sur Continu et définissez l’intensité du laser, le temps d’exposition, la puissance du laser et la position de la feuille de lumière. Ensuite, appuyez sur stop pour terminer l’acquisition d’images.

Il est important de s’assurer que l’échantillon transparent est positionné dans le trajet lumineux le plus court pour permettre l’acquisition détaillée d’images de fines structures verticales sur les nerfs moteurs individuels.

Pour l’acquisition multidimensionnelle, définissez la pile Z en déplaçant la position Z de la première et de la dernière image. Cliquez sur Optimal pour définir le numéro de tranche. Cliquez ensuite sur Démarrer l’expérience pour acquérir la pile Z sélectionnée. Lorsque c’est fait, enregistrez l’image au format point CZI.

Pour quantifier l’arborisation axonale, ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’imagerie. Ajustez la couleur, la luminosité et le contraste de l’image à l’aide de la fenêtre de réglage de l’écran pour détecter les filaments en fonction du contraste d’intensité locale. Ensuite, cliquez sur l’icône Ajouter de nouveaux filaments et sélectionnez l’algorithme de trajectoire automatique dans le menu déroulant. Sélectionnez la région qui vous intéresse.

Ensuite, définissez les points de départ et d’amorçage en attribuant les mesures de diamètre les plus grandes et les plus fines, qui peuvent être mesurées à l’aide du mode tranche. Attribuez un point de départ à la limite de la région d’intérêt. Pour effectuer l’ajout ou la suppression manuelle de points de départ, commencez par modifier le mode de pointeur, Naviguer dans la sélection, puis Maj et cliquez avec le bouton droit sur les points d’intérêt.

Ensuite, sélectionnez Seuils manuels pour les points de départ pour vous assurer que toute l’arborisation visible est marquée. Ensuite, ajoutez ou supprimez manuellement des points de départ. Cochez la case Supprimer les segments déconnectés et supprimez les points de départ autour des points de départ. Ensuite, ajustez le seuil de soustraction d’arrière-plan et terminez le processus.

Il est nécessaire d’éliminer les artefacts d’arrière-plan et de confirmer que la trajectoire du détecteur reflète la véritable arborisation des axones pour une quantification précise.

À la fin, choisissez le style et la couleur souhaités. Sous l’onglet Statistiques, sélectionnez détaillé et utilisez les points terminaux de dendrite du nombre de filaments pour quantifier les terminaisons nerveuses motrices en tant qu’indicateur de l’arborisation des axones moteurs. Ensuite, exportez l’image de l’axone reconstruit sous la forme d’un . TIFF fichier.