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Neurosciences
0 vues • 3:34 min • May 29th, 2025
Commencez par des sections tangentielles préfixées des sections corticales cérébrales aplaties. Laver pour éliminer les traces fixatrices.
Teindre les sections avec une solution de diaminobenzidine ou DAB et de sulfate de nickel-ammonium.
Le DAB se diffuse dans les neurones corticaux et réagit avec la cytochrome oxydase dans les mitochondries, formant un précipité sombre. Le sulfate de nickel-ammonium assombrit le précipité, améliorant le contraste.
Ajoutez du paraformaldéhyde pour arrêter la réaction de coloration, puis rincez.
Montez les sections sur une lame et déshydratez-les avec des lavages à l’éthanol.
Rincez avec de l’isopropanol et du xylène pour dégager la section et améliorer la transmission de la lumière.
Appliquez un support de montage et placez-y une lamelle. Lorsqu’ils
sont imagés au microscope à fond clair, à l’intérieur des neurones corticaux, les précipités absorbent et diffusent la lumière, ce qui les fait paraître sombres.
En revanche, les zones non tachées et dégagées transmettent la lumière et apparaissent brillantes.
Ce contraste met en évidence les modules corticaux comme des structures sombres et inégales sur un fond plus clair, représentant des groupes neuronaux actifs impliqués dans le traitement de l’information sensorielle.
Lavez le mouchoir dans le tampon HEPES pendant 15 minutes en l’agitant doucement. Pendant le lavage, préparez une solution fraîche de coloration à la cytochrome oxydase et ajoutez le composant DAB juste avant de l’utiliser. Maintenant, incubez les sections dans la solution de coloration fraîchement préparée à température ambiante avec un agitateur. Et veillez. Selon la quantité de fixation, la coloration peut être observable en 10 minutes, ou cela peut prendre plusieurs heures.
Si la réaction est trop lente, augmentez la température à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction, transférez les sections dans un bain à 4 % de PFA et laissez-les incuber pendant 15 minutes en agitant doucement. Ensuite, lavez les sections trois fois avec un tampon HEPES pendant 10 minutes par lavage.
Maintenant, montez et séchez les sections sur des lames de verre, et déshydratez-les à l’aide de bains d’éthanol de plus en plus forts. Ensuite, lavez les lames à l’isopropanol pendant 5 minutes, puis au xylène pendant cinq minutes. Après le bain de xylène, ajoutez immédiatement un produit de montage non à base d’eau à durcissement rapide. Les médiums à base d’eau dégraderont la tache. Après avoir ajouté une lamelle, stockez les lames à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient imagées.