Analyse des cellules immunitaires dans les tissus nerveux de souris à l’aide de la cytométrie en flux

Incuber avec des

anticorps marqués au fluorophore contre CD45 et CD11b, et avec des anticorps marqués à la biotine contre le CMH de classe II, pour marquer les cellules immunitaires.

Incuber avec de la streptavidine marquée au fluorophore qui se lie à la biotine.

Traiter avec un fixateur pour stabiliser la structure cellulaire.

Introduire un tampon de perméabilisation avec une coloration fluorescente à l’ADN pour perméabiliser les membranes et marquer les noyaux.

À l’aide d’un cytomètre en flux, faites passer les cellules à travers le faisceau laser pour évaluer les caractéristiques optiques et de fluorescence.

Retirez les agrégats avec une fluorescence d’ADN plus élevée pour isoler les cellules individuelles et détecter la fluorescence des marqueurs.

Identifier les cellules exprimant CD45, un marqueur caractéristique des cellules immunitaires, en confirmant leur présence.

La plupart des cellules CD45 positives de la DRG expriment CD11b et CMH de classe II, indiquant des cellules de type microglie, qui sont absentes dans les nerfs sciatiques.

Cette technique complète l’imagerie pour l’analyse de l’hétérogénéité des cellules immunitaires au sein des tissus nerveux.

Sur l’ordinateur, sélectionnez les canaux appropriés pour la détection des fluorophores d’intérêt, le débit approprié pour les échantillons et le nombre total d’événements à collecter par échantillon. Le nombre minimum d’événements doit être de 1 million.

Ensuite, créez des nuages de points sous une feuille de calcul globale de la diffusion latérale A par rapport à la diffusion directe A, ainsi que pour chaque fluorophore d’intérêt par rapport à la diffusion directe A. Créez également une vue statistique qui affichera le nombre d’événements et l’intensité moyenne de fluorescence pour les fluorophores sélectionnés.

Déterminez la porte parente P1 sur la base du nuage de points à partir des contrôles de coloration DAPI uniquement. Fixez l’échantillon à la cytométrie en flux et cliquez sur Acquérir. Observez le graphique DAPI en fonction du diagramme FSC et réduisez la tension du canal DNA Pacific Blue jusqu’à ce que la population DAPI-plus devienne visible. À l’aide de l’outil de contrôle rectangulaire, dessinez une boîte autour de la population DAPI-plus. Il s’agit de la porte P1. Sélectionnez les nuages de points pour chacun des fluorophores et affichez uniquement les événements DAPI-plus. Il s’agit de la fluorescence de fond de chacun des fluorophores.

À l’aide de l’outil de contrôle rectangulaire, tracez une case dans les nuages de points pour chacun des fluorophores, en commençant par 103 sur l’axe des y. Cette porte représente la région dans laquelle les événements positifs pour chacun des marqueurs énoncés doivent être trouvés. Ajustez les tensions de chacun des fluorophores à l’aide des commandes de coloration DAPI uniquement. Fixez l’échantillon à la cytométrie en flux et cliquez sur Acquérir.

Observez la position de la population DAPI-plus pour chacun des fluorophores et ajustez les tensions respectives de sorte que les populations tombent en dehors de la porte rectangulaire. Une fois le cytomètre en flux configuré, analysez les échantillons et exportez les fichiers de diffusion vers l’avant pour une analyse plus approfondie.