Ablation sélective au laser d’un seul neurone chez une larve de poisson-zèbre à l’aide d’un microscope confocal

Prenez une solution d’agarose préchauffée contenant une larve de poisson-zèbre transgénique anesthésiée exprimant une protéine fluorescente dans les motoneurones de la colonne vertébrale.

Transférez la larve dans un plat en verre avec un anneau d’agarose.

À l’aide d’un microscope, retournez la larve sur le côté. Ensuite, laissez l’agarose se solidifier, immobilisant la larve.

Ajouter un tampon contenant un anesthésique pour maintenir l’anesthésie.

Placez la parabole sur la platine du microscope confocal et utilisez l’imagerie en fond clair pour localiser la région de la moelle épinière dorsale.

Passez en mode fluorescence pour visualiser les motoneurones fluorescents.

Déterminez le plan z central du soma cellulaire pour un ciblage précis de l’ablation.

Configurez les paramètres d’imagerie pour une acquisition haute résolution tout en minimisant les photodommages.

Une fois que le plan z souhaité est net, effectuez l’ablation sur la région du neurone cible à l’aide d’un laser ultraviolet focalisé.

L’énergie laser perturbe les structures cellulaires, provoquant une perte de fluorescence et la mort cellulaire. La perte de fluorescence irréversible confirme une ablation précise sans affecter les cellules environnantes.

À l’aide d’une pipette réglable, aspirez une larve et laissez-la couler au fond de la pointe. Déposez la larve dans un volume minimal de liquide dans de l’agarose préchauffée, puis aspirez le poisson avec de l’agarose et distribuez-le rapidement dans un plat à fond de verre de 35 millimètres préalablement préparé. À l’aide d’un microscope de dissection, à l’aide d’un pinceau standard, positionnez l’animal, ou plusieurs animaux, à l’intérieur de l’agarose sur leurs flancs, de sorte que le corps et la queue soient plats.

Laissez le poisson incrusté reposer pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit fermement prise. Ensuite, utilisez environ deux millilitres d’eau d’œuf avec du trikane pour remplir soigneusement la boîte de Pétri de 35 millimètres. Placez la boîte de Pétri avec une larve incrustée sur la platine du microscope confocal et, à l’aide de l’éclairage en fond clair et d’un grossissement de 40X, faites la mise au point sur la face dorsale de la moelle épinière de l’animal. Passez à un réglage fluorescent approprié et visualisez la structure d’intérêt pour confirmer que tous les paramètres d’imagerie sont nécessaires pour l’ablation ultérieure.

Pour déterminer l’épaisseur de la structure pour l’ablation laser UV, utilisez le lecteur Z pour vérifier le haut et le bas de la structure d’intérêt en effectuant manuellement la mise au point vers le haut et vers le bas. Enregistrez manuellement le plan Z qui sera ablaté, par exemple, le centre de la cellule. Pour effectuer une ablation laser, lancez l’assistant FRAP en cliquant sur le menu déroulant en haut du menu du logiciel.

Dans la nouvelle fenêtre, déterminez les paramètres d’image pour l’approche d’ablation en sélectionnant le format, la vitesse de balayage et le calcul de la moyenne. Si le plan Z pour l’ablation n’a pas encore été sélectionné, appuyez sur le bouton en direct et faites la mise au point sur l’échantillon jusqu’à ce que la structure fluorescente ou le plan Z souhaité à ablater soit net. Une fois les paramètres généraux de l’image définis, accédez à l’étape de blanchiment pour contrôler les composants d’ablation spécifiques, puis engagez le laser de 405 nanomètres en l’activant pour la procédure de blanchiment.

Ensuite, utilisez l’option de zoom avant pour maximiser l’intensité du blanchiment au niveau de la zone d’intérêt sélectionnée en réduisant le champ de balayage, maximisant ainsi le temps de séjour. Sélectionnez un ou plusieurs ROI pour l’ablation à l’aide de l’un des outils de dessin de la fenêtre d’acquisition d’image. Ciblez la butte axonale, par exemple, avec l’outil de dessin circulaire d’environ 4 à 8 micromètres.

Après avoir établi le retour sur investissement, sélectionnez le bouton de parcours temporel et confirmez le nombre de cycles pendant lesquels les retours sur investissement seront scannés et ablatés. Choisissez les images avant et après le blanchiment comme vous le souhaitez pour permettre une vue d’ensemble de l’image juste avant et immédiatement après le processus de blanchiment.

Ces paramètres permettent aux chercheurs plusieurs couches de raffinement. Grâce à l’ajustement de la puissance laser, de la vitesse de balayage, de la moyenne des lignes, de la taille de la région d’intérêt et des répétitions, cette technique offre un haut degré de liberté pour provoquer le stress ou la mort dans les cellules individuelles.

Après avoir établi tous les paramètres d’ablation nécessaires, appuyez sur Exécuter l’expérience et surveillez l’efficacité de l’ablation. Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte.