Imagerie à double fluorescence pour identifier les oligodendrocytes différenciés

Prenez une culture de cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), isolées du cerveau d’un petit rat, qui ont été induites à se différencier en oligodendrocytes. Les cellules sont fixées pour préserver l’architecture cellulaire.

Les oligodendrocytes différenciés expriment la protéine basique de la myéline, ou MBP, un marqueur des oligodendrocytes matures, tandis que les OPC et les cellules différenciées expriment le facteur de transcription des oligodendrocytes 2, ou Olig2.

Appliquez une solution bloquant la perméabilisation et incubez avec agitation, perméabilisant les membranes cellulaires et bloquant les sites de liaison non spécifiques.

Ajouter des anticorps primaires ciblant les marqueurs et incuber en agitant pour permettre la liaison.

Laver pour éliminer les anticorps non liés, puis ajouter différents anticorps secondaires conjugués aux fluorophores spécifiques aux anticorps primaires et incuber avec agitation.

Lavez les cellules, puis placez-les dans un système d’imagerie à double fluorescence.

Utilisez la lumière de longueurs d’onde spécifiques pour exciter les fluorophores distincts et détecter les signaux émis pour visualiser les marqueurs.

Identifier les oligodendrocytes différenciés exprimant olig2 et MBP parmi les OPC indifférenciés exprimant uniquement olig2.

Amenez l’assiette à température ambiante. Aspirez les puits et ajoutez-y 250 microlitres de DPBS contenant 5 % de NGS et 0,1 % de Triton X-100. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure en secouant doucement l’orbite. Préparez la solution d’incubation primaire en diluant l’anticorps monoclonal anti-MBP de souris et l’anticorps polyclonal anti-OLIG2 de lapin dans un DPBS contenant 5 % de NGS. Ensuite, incubez les anticorps primaires à 4 degrés Celsius pendant la nuit pendant 16 à 18 heures avec une légère agitation orbitale.

Pendant le lavage de la plaque, préparez la solution d’incubation secondaire en diluant les anticorps anti-souris 680 et anti-lapin 800 dans du DPBS contenant 5 % de NGS. Ensuite, aspirez le lavage final et ajoutez 250 microlitres de solution d’incubation secondaire. Protégez la plaque de la lumière et incubez-la à température ambiante pendant une heure en secouant doucement l’orbite.

Ensuite, scannez la plaque à l’aide d’un système d’imagerie capable de détecter des émissions de fluorescence de 700 nanomètres et 800 nanomètres. Comme point de départ, réglez le décalage focal à 3 et les sensibilités à 1,5 pour la MBP, 5,0 pour l’actine et 3,5 pour l’OLIG2. Ajustez les valeurs de sensibilité si nécessaire pour éviter une surexposition du signal.