Visualisation des mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques

Commencez par une coupe de tissu cutané épidermique contenant des fibres nerveuses intraépidermiques ou IENF, de fines terminaisons neuronales sensorielles.

Les IENF sont riches en mitochondries, fournissant de l’énergie pour la transmission du signal neuronal.

Le tissu a des IENF, des mitochondries et des noyaux épidermiques marqués par fluorescence.

À l’aide d’un microscope confocal inversé, acquérez séquentiellement des signaux fluorescents discrets à des longueurs d’onde appropriées pour les noyaux, les IENF et les mitochondries.

Activez un balayage en direct pour capturer le signal IENF, englobant la couche épidermique.

Ensuite, effectuez un balayage séquentiel de chaque signal afin d’éliminer la diaphonie du signal de fluorescence.

À partir de l’image combinée, à l’aide du logiciel, recadrez et isolez les cellules épidermiques fluorescentes bleues.

Ensuite, traitez la zone recadrée pour améliorer la résolution des signaux IENF verts et des signaux mitochondriaux rouges.

Ensuite, générez une image de surface 3D pour créer un masque pour les IENF, puis superposez-la sur l’image de surface mitochondriale pour isoler les mitochondries spécifiques aux nerfs.

Dans la sortie finale, les IENF apparaissent en cyan, tandis que les mitochondries apparaissent sous la forme de minuscules structures de couleur magenta.

Sélectionnez l’objectif à immersion dans l’huile 40x sur un microscope confocal à balayage laser inversé. Sélectionnez les lasers et les détecteurs appropriés pour imager les noyaux, les fibres nerveuses et les mitochondries. Entrez les paramètres de balayage suivants dans le logiciel du microscope : résolution d’intensité de 12 bits. Vitesse de balayage de 600 Hz avec moyenne de deux images et zoom de 2,2. Réglez le logiciel du microscope pour une résolution latérale optimisée en sélectionnant une résolution de balayage de 1024 par 1024. Optimisez la résolution axiale et le sectionnement optique en sélectionnant une ouverture confocale d’une unité d’air avec une taille de pas z de 210 nanomètres.

Scannez chaque signal séparément et ajustez la tension et le décalage du détecteur pour supprimer les pixels saturés ou sous-saturés. Activez un balayage en direct du signal nerveux et ajustez la commande z focus pour trouver et régler les plans focaux supérieur et inférieur dans le logiciel du microscope qui englobent le signal nerveux dans la section du tissu. Scannez la série z finale avec un balayage séquentiel pour éliminer la diaphonie du signal fluorescent.

Isolez l’épiderme de la couche cornée et du derme en dessinant une région autour de l’épiderme, à l’aide d’un outil de sélection sur une image dupliquée de l’image originale. Recadrez ensuite l’image à la sélection. Calculez les fonctions d’étalement des points pour les signaux confocaux de fluorescence vert et rouge, à l’aide de la fonction de calcul de la fonction d’étalement. Réglez ensuite les paramètres de l’indice de réfraction moyen pour l’huile à 1,515 et l’ouverture numérique pour l’objectif d’huile 40x à 1,25. Réglez le sténopé du détecteur sur une zone, unité et choisissez une longueur d’onde d’excitation laser.

Utilisez une restauration itérative réglée avec un niveau de confiance de 100 %, une limite d’itération de 10 cycles et les PSF vert et rouge pour la déconvolution des signaux de fluorescence verts et rouges. Utilisez l’outil Créer une surface pour créer une surface autour des signaux nerveux déconvolutés, en sélectionnant la fonction lisse non vérifiée, l’intensité absolue pour le seuillage, un seuil inférieur de 3 000 et un seuil supérieur de 65 535. Gardez les surfaces au-dessus de 10 voxels.

Retirez les surfaces non nerveuses à l’aide de l’onglet Modifier de la surface nerveuse pour sélectionner des surfaces non nerveuses uniques, ou maintenez la touche Ctrl enfoncée pour sélectionner plusieurs surfaces non nerveuses. Supprimez les surfaces non nerveuses sélectionnées en appuyant sur le bouton Supprimer. Utilisez l’onglet Modifier dans la surface nerveuse et appuyez sur le bouton Masquer tout dans les propriétés du masque.

Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Canal 5 Mitochondries déconvolutées sous la sélection Canal, puis cochez Canal en double avant d’appliquer le masque. Appuyez sur le bouton radio pour une constante à l’intérieur à l’extérieur et vérifiez que la surface extérieure des voxels est réglée sur 0,0. Et appuyez sur le bouton OK.

Enfin, créez des surfaces spécifiques aux mitochondries à l’aide de l’outil Créer une surface pour créer une surface autour des signaux mitochondriaux déconvolués masqués en sélectionnant la fonction Lisse non cochée et en utilisant la soustraction d’arrière-plan pour le seuillage. Réglez le diamètre de la plus grande sphère à 1,50 micromètre, le seuil inférieur à 2 000 et le seuil supérieur à 65 535 au maximum. Assurez-vous de garder les surfaces au-dessus de 1,0 voxels.