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Prenez une section de tissu cérébral de souris coupée et incrustée de résine contenant l’hippocampe.
La section est colorée avec des métaux lourds pour améliorer le contraste au microscope électronique.
Montez la section sur une broche en aluminium à l’aide de colle cyanoacrylate.
Enduire les côtés du bloc de pâte d’argent colloïdal pour créer un chemin conducteur vers la broche en aluminium.
Examinez le bloc de tissu à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face de bloc en série (SBFSEM).
À l’intérieur du SBFSEM, l’ultramicrotome découpe séquentiellement le bloc en couches ultraminces tandis qu’un faisceau d’électrons à basse tension balaie la surface exposée.
Un détecteur d’électrons rétrodiffusés capture des images 2D haute résolution, révélant les mitochondries et les structures cellulaires environnantes.
À l’aide d’un logiciel approprié, ajustez la luminosité et le contraste pour améliorer la clarté de l’image.
Alignez les images séquentielles pour reconstruire un volume 3D du tissu cérébral. Cette reconstruction 3D permet une cartographie précise de la morphologie mitochondriale, de la distribution spatiale et de leurs relations au sein des compartiments neuronaux.
Coupez les échantillons à la zone d’intérêt et montez-les sur une goupille en aluminium à l’aide de superglue cyanoacrylate gélifiante. Enduisez ensuite l’échantillon d’une pâte d’argent colloïdal sur les côtés du bloc pour fournir un chemin conducteur vers la broche en aluminium. Examinez les échantillons de tissus à l’aide d’un système de microscope électronique à balayage équipé d’une platine d’ultramicrotome dans la chambre et d’un détecteur d’électrons rétrodiffusés de faible kilovolts.
Imagez les échantillons avec ces paramètres. Commencez l’analyse en sélectionnant le type d’image, puis 8 bits pour convertir les images au format TIFF 8 bits à partir du format propriétaire d’origine 16 bits. Si la conversion automatique du contraste et/ou de la luminosité au cours de cette étape n’est pas idéale pour les images, rouvrez les images 16 bits et appuyez sur image. Ajustez le contraste de luminosité.
Sélectionnez une plage qui fonctionne pour toutes les images et appuyez sur Appliquer. Effectuez ensuite la conversion. S’il y a eu un mouvement d’image inacceptable entre les tranches, alignez les piles d’images en sélectionnant Plug-ins, Enregistrement et alignement linéaire de la pile avec SIFT et définissez l’alignement pour le mode de traduction uniquement plutôt que pour le corps rigide.
Agrandissez la taille du canevas avant l’enregistrement en sélectionnant l’option Ajuster l’image Ajuster la taille du canevas. Vous pouvez également réduire l’image à une zone d’intérêt en sélectionnant la région souhaitée, puis en la recadrant. Si nécessaire, mettez les images à l’échelle à une taille plus petite et plus facile à gérer à l’aide de l’image j, puis en sélectionnant image et échelle.