Imagerie par photoactivation par fluorescence du transport des neurofilaments dans les axones de souris myélinisés

Commencez par un ensemble de perfusion placé sur la platine d’un microscope inversé.

L’ensemble de perfusion contient un nerf périphérique disséqué fixé entre une lamelle de recouvrement et une lame de micro-aqueduc avec une perfusion saline continue.

Les axones myélinisés du nerf expriment les neurofilaments verts marqués au fluorophore.

À l’aide d’un éclairage en fond clair, concentrez-vous sur les axones myélinisés.

Passez en mode confocal, photoblanchissez avec une puissance laser élevée, puis capturez une image de référence à faible autofluorescence à l’aide d’une faible puissance laser.

Tracez des lignes parallèles le long de l’axone pour définir la longueur de la fenêtre de photoactivation. Utilisez-le comme guide pour créer une zone d’activation rectangulaire.

Illuminez cette région avec une longueur d’onde spécifique pour activer les neurofilaments marqués au fluorophore vert, ce qui les rend fluorescents. Acquérez l’image.

Après l’activation, capturez des images en accéléré.

Au fil du temps, les neurofilaments fluorescents se déplacent dans les deux sens et se propagent dans les régions latérales adjacentes.

L’apparition de fluorescence dans les régions flanquantes adjacentes à la région d’activation confirme le transport des neurofilaments.

Saisissez l’extrémité proximale du nerf et déposez-la lentement sur une lamelle. Ensuite, redressez-le sous une légère tension. Placez la glissière du micro-aqueduc sur le nerf avec la glissière rainurée vers le bas et positionnez la direction de l’écoulement parallèlement au nerf. Retournez la lamelle de recouvrement et l’ensemble de micro-aqueduc et placez-le dans le boîtier de la chambre de perfusion avec la glissière opposée au joint extérieur.

Pour fixer la chambre de perfusion, placez-la dans le boîtier métallique et tournez la bague de verrouillage. Appuyez lentement sur le piston de la seringue de sérum physiologique et remplissez la chambre de perfusion. Gardez le tube d’entrée et de sortie, le flacon de sortie et la seringue surélevés au-dessus de la chambre elle-même à tout moment pendant la configuration et l’imagerie. Transférez l’ensemble de perfusion sur une platine de microscope inversé et montez la seringue saline dans le pousse-seringue. Ensuite, démarrez le moteur et ajustez la vitesse pour un débit de 0,25 millilitre par minute.

Connectez le réchauffeur de solution en ligne et réglez-le à 37 degrés Celsius. Connectez l’appareil de chauffage de l’objectif et réglez-le à 37 degrés Celsius. Appliquez de l’huile sur l’objectif et insérez la chambre de perfusion dans le support de scène. Appliquez de l’huile sur le tampon chauffant de la chambre et fixez-le à la chambre de perfusion. Ensuite, connectez-le et réglez-le sur 37 degrés Celsius.

Verrouillez la chambre de perfusion dans l’adaptateur de platine et mettez l’huile de l’objectif en contact avec la lamelle de recouvrement située sur la face inférieure de la chambre. Utilisez un éclairage en fond clair pour faire la mise au point sur la couche d’axones située sur la surface inférieure du nerf la plus proche de la surface de la lamelle. Les axones myélinisés peuvent être identifiés par la présence d’une gaine de myéline, qui est visible sous un éclairage en lumière transmise en fond clair sans amélioration du contraste.

Acquérez une image de référence en fond clair, enregistrant la directionnalité du nerf. Acquérez ensuite une image confocale à l’aide d’un laser de 488 nanomètres et d’un filtre d’émission adapté à la GFP photoactivable. Réglez la puissance du laser sur environ cinq fois la puissance d’imagerie normale et acquérez une image avec un temps d’exposition de trois à quatre minutes. Acquérez ensuite une autre image confocale pour enregistrer l’autofluorescence de pré-activation après l’étape de blanchiment.

Tracez une ligne parallèle aux axones d’une longueur égale à la taille de fenêtre d’activation souhaitée de l’image en fond clair. En utilisant cette ligne comme guide, tracez une région d’intérêt rectangulaire dans le champ de vision perpendiculaire aux axones. Activez la fluorescence GFP dans cette région par excitation de motif avec la lumière de 405 nanomètres, en vous assurant qu’une image est acquise juste avant et immédiatement après l’activation. Une fois l’activation terminée, démarrez une minuterie d’une minute. Lorsqu’il se déclenche, lancez l’acquisition d’une série time-lapse.