Microscopie à deux photons pour l’imagerie de la morphologie neuronale chez un bébé souris

Commencez par configurer la lumière d’excitation pour le microscope à deux photons.

Prenez un bébé souris transgénique anesthésié avec une fenêtre d’imagerie circulaire en verre et une plaque frontale implantée dans son crâne.

Les neurones expriment des protéines fluorescentes rouges pour faciliter l’imagerie.

Nettoyez la fenêtre d’imagerie en verre et fixez le chiot sur la platine d’imagerie à deux photons.

Alignez la fenêtre d’imagerie avec l’objectif du microscope en ajustant la tête du chiot.

Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle du chiot.

Ajustez le débit de l’anesthésique.

Appliquez une goutte d’eau sur la lamelle, puis abaissez la lentille de l’objectif du microscope.

La microscopie à deux photons utilise deux photons de lumière pour activer les protéines fluorescentes, ce qui permet une imagerie neuronale détaillée avec un minimum de bruit de fond et de photoblanchiment.

Capturez des images des neurones à différentes profondeurs pour visualiser leur structure

Enfin, empilez les images pour générer une représentation tridimensionnelle du neurone, y compris leurs projections neuronales, afin d’étudier les changements morphologiques liés à la croissance.

Pour commencer l’imagerie, réglez d’abord la longueur d’onde du laser à deux photons. Pour l’excitation RFP, utilisez une longueur d’onde de 1 000 nanomètres. Essuyez la surface de la lamelle avec de l’éthanol à 70 %. Fixez le chiot anesthésié à la plaque de titane de la platine d’imagerie à l’aide de la barre de titane. Utilisez la platine du goniomètre pour régler la tête de sorte que la lamelle soit parallèle à la lentille de l’objectif.

Maintenez la température corporelle du petit pendant l’imagerie, à l’aide d’un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius, et réduisez la concentration d’isoflurane à 0,7 % à 1 %. Placez la platine d’imagerie sous l’objectif 20X du microscope à deux photons. Appliquez une goutte d’eau sur la lamelle.

Configurez le logiciel pour qu’il acquière des images de pile z à des intervalles de 1,4 micron. Pour l’imagerie neuronale de couche quatre, réglez la largeur z entre 150 et 300 microns pour imager l’ensemble de la morphologie dendritique. Utilisez un balayage lent et une moyenne pour obtenir des images claires montrant la morphologie neuronale.

Il faut généralement plus de 20 minutes pour acquérir l’ensemble de la morphologie dendritique.