Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:54 min • May 29th, 2025
Fixez une drosophile transgénique immobilisée avec la tête exposée dans une chambre d’enregistrement sur une platine de microscope à fluorescence.
Le corps champignon de la mouche comprend des neurones exprimant la protéine de fusion bioluminescente sensible au calcium, qui est activée par un cofacteur préchargé.
Connectez un tube de perfusion à la chambre. Localisez les corps de champignons fluorescents, en vous concentrant sur le calice et les lobes médiaux. Confirmez le drainage à l’aide d’un tampon. Définissez
les paramètres d’imagerie et concentrez-vous sur le calice et les lobes médiaux. Dans l’obscurité, acquérez des images de fluorescence de référence des corps des champignons avant l’exposition aux stimulants.
Perfuser la nicotine dans un tampon contenant du calcium pour activer les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, déclenchant l’afflux de calcium et l’émission de lumière bioluminescente.
Laver avec un tampon pour rétablir les conditions de base.
Perfuser du chlorure de potassium pour dépolariser les neurones, déclenchant la libération de calcium intracellulaire et l’émission de signaux bioluminescents.
Laver avec un tampon pour rétablir les conditions de base.
Analyser des images pour évaluer l’activité spatiale et temporelle du calcium dans le calice et les lobes médiaux.
- Ensuite, placez l’échantillon sur la monture sous le microscope et ajustez le grossissement à 5x. Ensuite, insérez le tube de perfusion dans le canal à travers la ponction. Réglez le microscope sur le mode fluorescent, puis centrez-le et faites la mise au point sur les corps des champignons. Une fois que les corps des champignons sont nets, réglez le grossissement à 20x. Recentrez l’image et ajustez la mise au point.
Ensuite, positionnez l’appareil de drainage au-dessus de la piscine de drainage et ajustez la hauteur du shunt de drainage de sorte que la pointe soit juste au-dessus de la piscine de drainage. Ensuite, rincez l’échantillon avec la solution de Ringer pendant 30 secondes pour vérifier que le drainage est adéquat. Enfin, abaissez le bouclier pour isoler l’appareil de toute lumière extérieure.
À l’aide du système automatisé du programme Photon Imager, ajustez finement la mise au point et prenez une image fluorescente de référence des corps de champignons. Ajustez la position des zones de région d’intérêt sur le calice, les corps cellulaires et les lobes médiaux en cliquant sur les zones et en les faisant glisser en position tout en maintenant la touche Ctrl enfoncée.
Maintenant, enregistrez les valeurs de référence pendant environ 5 à 10 minutes. Ensuite, allumez l’interrupteur pour commencer l’écoulement de la nicotine. En même temps, appuyez sur Entrée et ajoutez une note pour signifier que le flux de nicotine a commencé. Au bout d’une minute, arrêtez le flux et notez une autre fois dans le journal indiquant que le flux a été arrêté. Ensuite, lavez l’échantillon avec la solution de Ringer pendant cinq minutes.
Pendant que l’échantillon récupère, éteignez le lavage, réglez la minuterie sur cinq minutes supplémentaires et préparez-vous à démarrer l’écoulement du chlorure de potassium. Lorsque vous êtes prêt à commencer, démarrez l’écoulement du chlorure de potassium et entrez 100 millimolaires de chlorure de potassium dans le registre d’échantillons. Au bout d’une minute, arrêtez l’écoulement et entrez le chlorure de potassium arrêté dans le registre d’échantillonnage. Ensuite, lavez l’échantillon avec la solution de Ringer pendant une minute et passez le microscope en mode fluorescent. Prenez une dernière image fluorescente, puis éteignez la solution de Ringer et retirez l’échantillon.