Ablation neuronale ciblée par microscopie à deux photons dans un larava de poisson-zèbre

Commencez avec une larve de poisson-zèbre transgénique anesthésiée immobilisée dans de l’agarose et placée dans une boîte de Pétri contenant une solution anesthésique.

Placez-le sous un microscope laser à deux photons, qui utilise deux photons pour une imagerie détaillée.

Concentrez-vous sur les couches supérieure et inférieure du cerveau pour définir les limites de l’imagerie.

Capturez des images à différentes profondeurs pour observer les neurones avant le traitement au laser.

Ajustez la mise au point sur la région d’intérêt et ajustez la taille de l’image pour affiner la mise au point sur les neurones.

Sélectionnez et irradiez les neurones à l’aide du laser à deux photons.

Le laser induit une chaleur localisée, entraînant la mort neuronale avec des dommages minimes aux tissus environnants. Capturez l’image.

Comparez les images avant et après le traitement pour évaluer les changements de fluorescence.

Refocaliser les neurones dans les plans plus profonds et répéter l’irradiation pour traiter tous les neurones de la région d’intérêt.

Capturez à nouveau l’image et comparez-la avec l’image de prétraitement. La perte de fluorescence après le traitement au laser confirme le succès de l’ablation neuronale.

Placez la larve incrustée d’agarose sous un microscope à balayage laser à 2 photons et démarrez le système de microscopie. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et, sous l’onglet Laser, cliquez sur le bouton activé pour allumer le laser. Attendez que l’état du laser passe de Occupé à Mode verrouillé.

Dans l’onglet Canaux, réglez la longueur d’onde du laser sur 880 nanomètres pour l’ablation EGFP ou 800 nanomètres pour l’ablation GcAMP. Sélectionnez l’objectif 20x en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif. Cliquez ensuite sur l’onglet Localiser. Cliquez sur GFP pour modifier les voies optiques et visualiser directement la fluorescence à l’œil nu. Centrez le cerveau de la larve de poisson-zèbre dans le champ de vision. Ensuite, cliquez sur l’onglet Acquisition pour revenir à la microscopie à deux photons et régler la puissance et le gain du laser.

Pour enregistrer la condition avant l’ablation, cliquez sur Pile Z pour sélectionner l’option Pile Z. Ensuite, après vous être concentré sur l’extrémité ventrale du cerveau larvaire, cliquez sur le bouton Définir en premier pour définir la limite inférieure. Et après vous être concentré sur la surface la plus dorsale du cerveau, cliquez sur le bouton Définir en dernier pour définir la limite supérieure. Enfin, cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience pour exécuter l’acquisition d’images Z-Stack.

Ensuite, sélectionnez l’objectif 63x en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif. Ensuite, cliquez sur l’onglet Localiser pour passer à la microscopie à épifluorescence. Centrer les cellules à ablater à l’œil. Cliquez ensuite sur l’onglet Acquisition pour revenir à la microscopie à balayage laser.

Dans l’onglet Mode d’acquisition, définissez la taille de l’image sur 256 par 256. Cliquez sur En direct et observez les neurones qui vous intéressent. Ensuite, en partant du côté le plus dorsal, trouvez un plan focal dans lequel les cellules à ablater sont focalisées. À l’aide de la fonction Régions, marquez une petite zone circulaire d’environ un tiers du diamètre de la cellule sur chaque neurone en tant que retour d’intérêt.

Réglez la vitesse de balayage sur 13,93 secondes par 256 x 256 pixels, ce qui correspond à un temps de séjour laser d’environ 200 microsecondes par pixel, ou 200 microsecondes par demi-micron. Réglez également le cycle d’itération sur 4 répétitions. Cliquez sur Démarrer l’expérience pour exécuter les fonctions de séries chronologiques et de blanchiment. Comparez l’image avant l’ablation à l’image après l’ablation dans le cycle de séries chronologiques, pour vous assurer que la fluorescence dans les cellules ciblées a disparu.

Ensuite, déplacez le plan focal légèrement plus profondément et choisissez le plan focal suivant où les cellules non ablées apparaissent. Effectuez la fonction de blanchiment comme nous venons de le démontrer, et répétez le processus jusqu’à ce que toutes les cellules de la structure neurale d’intérêt aient été ablatées. Après l’ablation, vérifiez que les cellules n’ont pas de fluorescence abolie et répétez l’irradiation laser si nécessaire.