Imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller pendant la régénération rétinienne du poisson-zèbre

Commencez par un explant rétinien dorsal incrusté d’agarose d’un poisson-zèbre transgénique, monté dans une boîte fluorescente avec un support.

La rétine présente des lésions des photorécepteurs induites par la lumière et contient des cellules gliales de Muller ou MGC avec des noyaux exprimant la GFP.

Placez la parabole dans une chambre de microscope multiphotonique.

À l’aide d’un éclairage en fond clair, faites la mise au point sur la rétine.

Passez en mode fluorescence pour localiser les MGC.

Configurez une pile z de la couche de cellules ganglionnaires ou GCL à la couche nucléaire externe ou ONL.

Démarrez l’imagerie en direct.

Les photorécepteurs endommagés libèrent du TNF-α, activant les MGC.

Les noyaux MGC migrent à la base de la couche nucléaire interne ou INL pour répliquer leur ADN.

Ensuite, les noyaux migrent apicalement vers l’ONL pour subir une mitose, produisant des progéniteurs neuronaux.

Après la mitose, les noyaux et les progéniteurs de la MGC migrent vers l’INL.

Les progéniteurs prolifèrent, migrent vers le site de la lésion et se différencient en photorécepteurs, permettant la régénération rétinienne.

Analysez les images capturées pour visualiser la migration nucléaire.

Dans le logiciel d’acquisition d’images, ouvrez les fenêtres A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI et ND Acquisition. Pour l’imagerie multiphotonique, assurez-vous que l’option IR NDD est sélectionnée dans la fenêtre A1 Compact GUI. Ensuite, dans le champ de réglage, sélectionnez IR-DM pour le premier miroir dichroïque et vérifiez que le filtre passe-bande est réglé sur 525 à 50 pour acquérir la fluorescence GFP.

Ensuite, allumez le laser IR dans la fenêtre de l’interface graphique A1 MP. Il faudra quelques minutes pour que le laser soit prêt. Après cela, réglez la longueur d’onde sur 910 nanomètres pour exciter la fluorescence GFP et aligner le laser en cliquant sur le bouton Alignement automatique.

Après avoir placé la culture rétinienne sur la platine du microscope multiphotonique, assurez-vous que les lumières de la pièce et de l’équipement sont éteintes avant d’ouvrir l’obturateur pour éviter une surexposition du tube photomultiplicateur. Pour réduire les niveaux de bruit, placez le microscope dans un environnement sombre.

Acquérez des images d’un champ de vision de 300 x 300 pixels avec un zoom de 2, qui sont définis dans la fenêtre Zone de balayage, et un temps d’habitation des pixels de 4,8 microsecondes par pixel choisi dans la fenêtre de l’interface graphique A1 Compact. Configurez grossièrement la puissance laser en modifiant la zone d’acquisition dans la fenêtre A1 MP GUI et le gain dans la fenêtre A1 Compact GUI.

Maintenant, concentrez-vous sur la couche de cellules ganglionnaires et définissez le plan focal supérieur de la pile z dans la sous-fenêtre Z de la fenêtre d’acquisition ND. Déplacez le plan focal à travers le niveau de la couche nucléaire externe, qui est caractérisée par la présence de cellules GFAP et GFP positives faiblement marquées, rondes et élargies par rapport à leurs homologues de la couche nucléaire interne.

Définissez ce plan comme le bas de la pile z. Ensuite, réglez la taille du pas z entre 0,7 et 1 micromètre. Pour configurer la correction de l’intensité z, ouvrez la fenêtre Correction de l’intensité z et choisissez À partir de ND pour définir la plage de la pile z. Ensuite, cliquez sur le plan focal inférieur dans la fenêtre de correction de l’intensité Z et réglez l’intensité et le gain du laser.

Ensuite, cliquez sur la flèche en regard des valeurs z dans la fenêtre Correction de l’intensité Z pour confirmer les paramètres qui s’affichent ensuite sous Paramètres du périphérique dans la fenêtre Correction de l’intensité Z pour le plan focal choisi. Répétez le processus pour les plans central et supérieur, en augmentant la puissance et le gain du laser.

Définissez la zone d’acquisition dans la fenêtre de l’interface graphique A1 MP et évitez de sélectionner une zone d’acquisition supérieure à 15 et un gain supérieur à 126 au début de l’imagerie pour contourner le photoblanchiment et l’augmentation des niveaux de bruit. Ensuite, choisissez la correction d’intensité relative dans la fenêtre Correction d’intensité Z. Dans la sous-fenêtre des séries chronologiques de la fenêtre Acquisition ND, définissez la durée sur huit heures et l’intervalle sur aucun délai. Ensuite, cliquez sur l’option Exécuter la correction Z dans la sous-fenêtre Z-Stack de la fenêtre Acquisition ND pour acquérir des séries chronologiques 3D.