JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:06 min • June 17th, 2025
Commencez avec des larves de poisson-zèbre transgénique anesthésiées dans une chambre de montage contenant un tampon physiologique oxygéné sous un stéréomicroscope.
Le cervelet dans le cerveau contient des neurones de Purkinje génétiquement modifiés exprimant des protéines cytoplasmiques fluorescentes.
Retirez l’excès de milieu, puis ajoutez de l’agarose fondue pour immobiliser les larves afin une imagerie stable.
Orientez les larves, côté dorsal vers le haut, pour visualiser le cervelet.
Une fois solidifié, coupez l’excès d’agarose. À l’aide d’une aiguille de verre, excisez la peau pigmentée recouvrant le cerveau pour l’exposer.
Retournez le bloc d’agarose sur une chambre d’imagerie contenant de l’agarose fondue pour l’imagerie sous un microscope inversé.
Ajouter le tampon physiologique pour préserver la fonction neuronale.
Placez la chambre sous un microscope confocal inversé. Appliquez une lumière d’excitation pour exciter les protéines fluorescentes, ce qui permet de visualiser les neurones marqués.
Les cellules pigmentées de la peau, si elles ne sont pas éliminées, diffusent et absorbent la lumière d’excitation, réduisant ainsi l’intensité de la fluorescence.
L’ablation de la peau améliore la pénétration de la lumière pour augmenter l’intensité de la fluorescence, facilitant ainsi la visualisation des neurones.
Pour enfoncer la larve, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférez la larve anesthésiée dans une chambre de montage sous stéréomicroscope. Si des larves sont encore capables de bouger, n’utilisez pas le poisson pour l’expérience jusqu’à ce que le poisson soit complètement incapable de bouger. Lorsque la larve est immobile, retirez soigneusement l’excès de milieu et ajoutez immédiatement au moins 1 millilitre d’agarose à bas point de fusion sur la larve.
Orientez le poisson-zèbre avec la région dorsale tournée vers le haut aussi près que possible de la surface de l’agarose. Si les larves doivent être imagées à l’aide d’un microscope inversé, après s’être solidifiées, coupez l’agarose contenant la larve en un petit bloc cuboïde. Pour exposer le cerveau à l’imagerie, coupez l’excès d’agarose sur la région cérébrale d’intérêt si nécessaire, et utilisez une aiguille de verre pour faire une petite incision à travers la peau près mais pas au-dessus de la région d’intérêt, sans pénétrer trop profondément dans le tissu.
En déplaçant à peine l’aiguille juste sous la surface de la peau, continuez à faire soigneusement de très petites entailles autour de la région d’intérêt jusqu’à ce que la peau au-dessus de la région d’intérêt puisse être retirée ou poussée de côté. Lorsque le tissu a été retiré de tous les embryons, ajoutez une petite goutte d’agarose à bas point de fusion dans une chambre d’imagerie préalablement préparée d’un microscope inversé, et utilisez une petite spatule pour retourner le bloc d’agarose cuboïde de 180 degrés sur la goutte d’agarose dans la chambre d’imagerie. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, remplissez la chambre d’imagerie avec de l’ACSF frais et commencez à imager la larve.