Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 6:52 min • June 17th, 2025
Placez un échantillon de tissu cérébral de souris et des étalons dans une chambre d’ablation laser.
Les normes contiennent des concentrations connues de métaux dopés dans des homogénats de tissu cérébral d’agneau.
Remplissez la chambre de gaz argon et concentrez un faisceau laser ultraviolet sur le tissu.
Le laser vaporise l’échantillon et les étalons de manière linéaire, créant un aérosol de fines particules.
Le gaz argon transporte les particules dans le plasma à couplage inductif, une source d’ionisation à haute température.
Le plasma atomise et ionise les particules en ions chargés positivement.
Les ions entrent dans le spectromètre de masse et sont séparés en fonction de leur rapport masse/charge.
Les données résultantes sont comparées à une base de données de référence pour identifier les métaux présents dans l’échantillon. À partir des normes, une courbe d’étalonnage est générée.
Calculez les concentrations de métaux dans l’échantillon en calibrant l’intensité de son signal par rapport à celles des étalons, révélant ainsi la distribution spatiale des métaux dans la tranche de cerveau.
Tout d’abord, placez un échantillon de tissu cérébral et tous les étalons de tissu appariés à la matrice dans la chambre d’ablation au laser. Assurez-vous que les échantillons se trouvent dans la profondeur de champ de la caméra LACCD. Fermez la porte de la chambre et serrez les vis à la main.
Ensuite, dans le logiciel ICP-MS, ouvrez la vanne de gaz porteur et réglez le débit à 1,2 litre par minute. Dans le logiciel LA, exécutez une purge de 30 minutes de la cellule d’ablation avec le gaz vecteur pour une cellule d’ablation à 2 volumes. Toutes les 10 minutes, déplacez l’étage d’échantillonnage dans chaque coin de la chambre pour réduire la quantité d’air résiduel dans la cellule.
Allumez l’ICP-MS et laissez l’instrument se réchauffer pendant deux heures. Pendant que l’instrument se réchauffe, dans le logiciel d’ablation laser, tracez une ligne d’ablation d’environ 3 millimètres de long sur la surface du premier étalon tissulaire. Cliquez sur la ligne d’ablation et définissez le diamètre du faisceau par défaut, la vitesse de balayage et la fluence rayonnante. Dupliquez la ligne six fois, en espaçant les lignes du diamètre du faisceau. Répétez ce processus pour chaque norme.
Ensuite, à l’aide de l’outil Ligne, tracez la zone d’ablation sur l’échantillon à partir du coin supérieur gauche jusqu’au point le plus large de l’échantillon, en utilisant les mêmes paramètres que pour les étalons.
Dupliquez la ligne au besoin pour couvrir complètement l’échantillon avec le même espacement que celui utilisé dans les normes. Tracez ensuite un ensemble de lignes pour le balayage intermittent des étalons au plus tard après 20 heures de balayage de l’échantillon ou entre chaque échantillon. Ajoutez un balayage des normes à la fin de l’expérience.
En fonction de la longueur de la ligne et de la vitesse de balayage, déterminez le temps d’analyse de l’échantillon et des lignes standard. Créez ensuite un nouveau lot dans le logiciel ICP-MS et sélectionnez Analyse résolue dans le temps. Choisissez les valeurs de rapport masse/charge qui vous intéressent et définissez les temps d’intégration pour chaque rapport, de sorte que le temps d’intégration total d’un cycle soit de 0,25 seconde. Enregistrez le lot.
Pour un lot standard, remplissez le temps d’analyse pour chaque ligne avec un tampon supplémentaire de 15 secondes pour tenir compte des temps de préchauffage et de lavage du laser. Définissez un exemple de liste d’exécution avec une acquisition pour chaque ligne standard. Pour le lot d’échantillons, dupliquez le lot standard et ajustez les temps et le nombre d’acquisitions en conséquence pour le modèle d’ablation de l’échantillon.
Une fois que l’ICP-MS s’est réchauffé, ajoutez le premier lot à la file d’attente et assurez-vous que le logiciel attend un déclencheur de l’instrument LA. Ensuite, dans le logiciel LA, allumez l’alimentation laser et réglez les temps de préchauffage et de lavage du laser. Démarrez la séquence laser et vérifiez que l’ICP-MS commence correctement la collecte de données après l’ablation.
Une fois les données collectées, extrayez les données des normes à partir des fichiers CSV. Effectuez une soustraction de la ligne de base et excluez le signal d’arrière-plan. Identifiez les chutes de signal causées par des trous dans les étalons tissulaires.
Masquez ces zones de signal faible, puis exportez les données sous forme de tableur. Calculez un facteur de conversion de CPS en PPM pour chaque élément identifié. Répétez ce processus pour chaque norme.
Ensuite, ouvrez le logiciel de construction d’images quantitatives et importez les données d’échantillonnage à partir des fichiers CSV. Sélectionnez plusieurs zones de l’arrière-plan pour appliquer la correction d’arrière-plan. Sélectionnez l’outil d’édition de graphique, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image, puis sélectionnez Modifier l’apparence de l’image. Remplacez la première couleur à Z par une valeur négative élevée.
Et cliquez sur Terminé pour améliorer le signal d’arrière-plan. Ensuite, dans l’onglet Normes, entrez les facteurs de correction CPS PPM pour chaque norme et cliquez sur OK. Ouvrez le navigateur de données dans l’onglet Données, cliquez avec le bouton droit de la souris sur un fichier image corrigé, puis cliquez sur Nouvelle image.
Ouvrez la fenêtre Modifier l’apparence de l’image et définissez la table des couleurs et l’échelle. Utilisez l’utilitaire Ajouter une annotation pour placer une échelle de couleurs sur l’image. Ajustez l’échelle de couleurs dans la fenêtre de l’échelle de couleurs. Une fois l’image colorée et annotée, copiez et collez l’image dans un autre programme ou exportez l’image à partir du logiciel de construction d’images.
Pour activer les outils de retour sur investissement, sélectionnez Traitement d’image dans les packages d’analyse et choisissez une image. Dans l’onglet Image, cliquez sur ROI et démarrez ROI Draw. Sélectionnez la région qui vous intéresse, puis cliquez sur Terminer le retour sur investissement.
Dans l’onglet Image, cliquez sur Statistiques pour obtenir les données de retour sur investissement. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul, en vous assurant de les enregistrer lorsque chaque retour sur investissement est ajouté. Répétez le processus si nécessaire.