Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

L’objectif général de l’expérience suivante est de développer un substrat bidimensionnel pour le contrôle de l’absorption des protéines et de la croissance cellulaire. Ceci est réalisé en utilisant la photolithographie pour fabriquer un maître à motifs, qui est utilisé pour produire un tampon A-P-D-M-S pour l’impression par micro-contact. Dans un deuxième temps, le substrat doré à motifs est préparé, ce qui implique une impression par micro-contact pour produire un motif avec des régions qui absorbent et résistent aux protéines.

Ensuite, des protéines et des cellules sont ajoutées au substrat afin de visualiser le motif et de l’étudier. On obtient des résultats de croissance et de comportement cellulaires qui montrent un bon confinement des protéines et des cellules sur ces substrats de motifs basés sur la fluorescence et la microscopie de contraste facial. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes, telles que l’impression MicroCon de protéines, est que la monocouche terminée par du glycol résiste à l’absorption non spécifique des protéines et des cellules en arrière-plan du motif.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la technique d’estampage appropriée doit être optimisée pour chaque motif imprimé. Pour commencer la préparation du centre maître à motifs, la plaquette de silicium sur le codeur de spin et, pendant l’étape initiale du programme de spin à deux cycles, rincez la plaquette avec de l’acétone. Au cours de la deuxième étape du programme d’essorage, l’acétone s’évapore pour laisser une plaquette propre et sèche au début de l’essorage, applique de la résine photosensible sur la plaquette, puis essore la couche en utilisant les conditions décrites précédemment.

Cuire doucement la gaufrette enrobée de résistance photo à 110 degrés Celsius pendant deux minutes à l’aide d’une plaque chauffante à haute uniformité. Motif photo suivant. La plaquette revêtue de photorésistance à l’aide d’un système d’alignement de masque et d’un masque approprié.

Tout d’abord, placez le substrat sur le camion aspirateur de l’aligneur de masques. Insérez ensuite le masque dans le plateau de support et allumez l’aspirateur pour maintenir le masque en place afin de confirmer un bon contact entre le masque et le substrat. Soulevez le substrat jusqu’à ce qu’il rencontre le masque.

Utilisez l’optique de l’aligneur pour confirmer qu’un bon contact a été établi. Enfin, allumez la lampe pour exposer le substrat à la lumière UV à travers le masque lithographique. Développez la plaquette à motifs dans un révélateur pendant une minute 45 secondes en l’agitant doucement.

Rincez abondamment avec de l’eau déminéralisée de qualité semi-conductrice et séchez avec un courant d’azote gazeux pour vérifier le développement du motif à l’aide d’un microscope avec un filtre UV. Commencez cette procédure en préparant un durcisseur de résine de 10 pour un en poids. Mélange de cigare 180 2 complètement.

Couvrez la plaquette à motifs photo avec le mélange dans une boîte de Pétri jetable dans une dessiccation sous vide Degas, le PDMS couvert maître jusqu’à ce qu’aucune bulle ne soit visible. Après vous être assuré que le maître est au fond du plat, laissez le tampon durcir dans un four à 65 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Lorsque le tampon PDMS est durci, découpez-le dans le master et coupez-le à la taille appropriée.

Rangez le timbre dans un contenant couvert, côté vers le haut, pour le protéger de la poussière et des débris. Pour préparer les substrats au dépôt de métal, traitez d’abord les lamelles de verre rondes avec du plasma d’oxygène pendant 10 minutes. Ensuite, rincez deux fois les glissières de couverture avec de l’eau désionisée en séchant avec le jet d’azote gazeux entre les rinçages après le rinçage à l’eau, rincez deux fois avec de l’éthanol en séchant à nouveau avec le flux d’azote gazeux entre les rinçages.

À l’aide d’un système de dépôt par faisceau d’électrons de poche multip, déposez 50 angströms de titane suivis de 150 angströms d’or. Ne pas plier l’évaporateur entre le dépôt de la couche de titane et de la couche d’or. Rincez le tampon PDMS avec de l’éthanol et séchez-le soigneusement.

Avec de l’azote gazeux, appliquez la solution d’estampage sur le tampon goutte à goutte jusqu’à ce qu’il soit complètement enrobé. Séchez soigneusement le timbre avec de l’azote gazeux. L’impression par micro-contact de la lime HEXA Decane dépend des caractéristiques du tampon PDMS et constitue l’un des aspects les plus difficiles de cette procédure.

Un emboutissage réussi nécessite le développement d’une bonne technique qui applique une pression uniforme. Pendant l’estampage. Pour l’impression conventionnelle par micro-contact à l’air, appuyez doucement le tampon sur le substrat doré et laissez la monocouche se former pendant 15 secondes.

Alternativement, pour les motifs composés de très petites caractéristiques et de rapports d’aspect élevés, placez le substrat d’or dans une boîte de Pétri contenant 18,2 méga d’eau désionisée, en veillant à ce que le substrat soit immergé. Ensuite, appuyez doucement le tampon sur le substrat doré et laissez la monocouche A se former pendant 15 secondes. Ensuite, rincez deux fois le substrat estampé avec un séchage à l’éthanol avec de l’azote gazeux.

Après chaque rinçage, placez le substrat dans une boîte de Pétri et recouvrez le substrat d’une solution de remplissage. Fermez le plat avec param pour éviter l’évaporation. Laissez la monocouche d’arrière-plan se former dans l’obscurité pendant 12 à 14 heures.

Enfin, retirez la lamelle à motifs de la solution de remplissage arrière et rincez deux fois à l’éthanol en séchant à l’azote gazeux après chaque rinçage. Pour appliquer des protéines sur la lamelle à motifs, placez la lamelle dans une petite boîte de Pétri ou une chambre de culture cellulaire Recouvrez de 500 microlitres à un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate delcos. Le DPBS doit recouvrir complètement le substrat pendant l’incubation des protéines.

Pour assurer une couverture protéique uniforme, ajoutez une solution concentrée de protéines au DPBS et mélangez la solution en pipetant plusieurs fois. Incuber le mélange de protéines avec le substrat à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, rincez abondamment le substrat avec du DPBS pour éliminer les protéines non liées, en prenant soin de ne pas sécher le substrat ou de ne pas l’amener par l’interface air-eau.

Après trois rinçages, aspirez le DPBS. Ajoutez ensuite environ 500 microlitres de milieu de croissance cellulaire complet pour maintenir un substrat humide. Remplacez le milieu de culture utilisé pour rincer le substrat.

Avec un milieu frais, le substrat est maintenant prêt pour le placage avec des cellules. En règle générale, 30 à 200 cellules par millimètre carré sont plaquées sur le substrat. Cette image montre le timbre A-P-D-M-S visualisé au microscope en plaçant la caractéristique du timbre côté vers le bas sur une lamelle de verre, la barre d’échelle est de 100 micromètres.

Un estampage approprié permet d’obtenir un motif protéique net et clair qui peut être visualisé par l’application d’une protéine marquée par fluorescence telle que la fibronectine marquée LOR 6 47. Le confinement des cellules chk one au motif protéique est montré ici. Les barres d’échelle mesurent 100 micromètres sur ces images.

Alternativement, l’immunohistochimie peut être utilisée pour visualiser le motif protéique après la fixation de SU. Ici, l’anticorps anti-laminé conjugué LOR 3 50 est utilisé pour visualiser un stratifié à motifs ensemencé avec des neurones de l’hippocampe de souris E 18 montré à quatre jours in vitro E 18 neurones de l’hippocampe de souris colorés avec MIT tracker red five 80 montrent que la croissance cellulaire est bien confinée au modèle protéique. Bien que cette technique soit facilement maîtrisée, plusieurs problèmes courants peuvent survenir, comme l’illustrent ces préparations de substrat de motif visualisées par l’absorption conjuguée de fibronectine LOR 6 47.

L’application de protéines sans mélange suffisant de la solution protéique concentrée dans le DPBS peut entraîner des profils protéiques inégaux. Un emboutissage incorrect peut entraîner un transfert partiel du motif ou l’effondrement du tampon. De plus, l’exposition à l’air du substrat du motif contenant la protéine absorbée peut perturber la monocouche, entraînant une diminution de la résistance.

En arrière-plan, les motifs immergés peuvent produire des motifs avec de petites caractéristiques qui sont difficiles à imprimer par l’impression conventionnelle par micro-contact et par air. Ces deux images montrent différentes régions du même motif imprimé avec le même tampon PDMS dans l’air ou des lignes de support d’eau déminéralisées sont montrées dans l’image de gauche pour démontrer que seules les petites caractéristiques du motif n’ont pas réussi à s’imprimer avec succès. Les barres d’échelle font 20 micromètres Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 18 à 24 heures si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’un substrat de motif. Produisez le tampon A-P-D-M-S. Utilisez l’impression par micro-contact pour préparer un substrat doré et visualisez ce motif à l’aide de protéines et de cellules.