Livraison de gènes sous-piaux dans la moelle épinière de souris pour évaluer l’expression des gènes

Prenez une souris anesthésiée, rasez-lui le dos et désinfectez la peau.

Incisez la peau, détachez les muscles des vertèbres et rétractez-les à l’aide de pinces.

Percez les lames vertébrales pour créer des fissures, puis retirez les fragments d’os pour exposer la dure-mère, la membrane externe de la moelle épinière.

À l’aide d’une aiguille, créez une ouverture durale et percez la pie-mère sous-jacente pour qu’elle pénètre dans l’espace sous-pial afin d’accéder directement au tissu rachidien.

Prenez une aiguille d’administration contenant une suspension de virus adéno-associé recombinant portant un gène exprimant une protéine fluorescente et injectez la suspension.

Retirez l’aiguille, suturez les muscles et la peau et laissez la souris récupérer.

Le virus se lie aux récepteurs des neurones et des cellules gliales et est endocytosé.

Une fois à l’intérieur du noyau, le virus déclenche l’expression génique pour produire des protéines fluorescentes.

Le modèle d’administration du gène sous-pial est maintenant prêt à évaluer l’expression du gène cible dans la moelle épinière.

Commencez par anesthésier correctement l’animal pour la chirurgie. L’isoflurane est utilisé ici. Assurez-vous de l’absence de réponse de pincement de la patte avant de continuer. Couvrez ensuite les yeux avec une pommade ophtalmique. Ensuite, rasez le dos de l’animal avec une tondeuse et nettoyez la peau avec de la chlorhexidine à 2 %.

Si des injections sous-piales lombaires doivent être effectuées, coupez la peau recouvrant les vertèbres T8 à L1 avec un scalpel. Ensuite, utilisez des ciseaux pour détacher le muscle paravertébral des vertèbres vertébrales T10 à T12. Montez l’animal dans un cadre stéréotaxique standard à l’aide de pinces vertébrales de souris. Ensuite, utilisez une fraise dentaire pour raser les deux côtés de la lame des vertèbres T10 à T12 jusqu’à ce que des fissures apparaissent.

Ensuite, utilisez une pince pour retirer les fragments d’os fissurés et exposer la surface dorsale de la moelle épinière lombaire. La dure-mère est maintenant visible. Utilisez une aiguille en acier inoxydable de calibre 30 pour faire une incision de 1 à 2 millimètres dans la dure-mère.

Il est important d’ouvrir soigneusement la dure-mère pour éviter de blesser la membrane pia sous-jacente.

Maintenant, saisissez le bord de la dure-mère coupée avec une pince et étendez l’ouverture de la dure-mère jusqu’à 5 millimètres. Montez l’aiguille pénétrante PIA de calibre 34 et l’aiguille d’injection de calibre 36 sur les bras Z de deux manipulateurs XYZ distincts à l’aide de supports capillaires en verre.

Ensuite, utilisez une micro-seringue de 50 microlitres connectée à un tube PE-10 ou PE-20 pour charger le virus AAV9-UBI-GFP. Une fois le virus chargé, connectez l’extrémité du tube à l’aiguille d’injection. Ensuite, tout en regardant à travers une lunette de dissection chirurgicale réglée sur un grossissement de 8 à 10x, utilisez le bras en X pour abaisser l’aiguille pénétrante de la pie, dans la pie, à une profondeur de 1 millimètre. Maintenez l’angle de l’aiguille pénétrante à 5 à 10 degrés, par rapport à la surface du tissu.

Après avoir ouvert la pie, utilisez le bras en X pour retirer l’aiguille pénétrante de la pia de l’espace sous-pial. Notez le site pénétré à l’aide d’un point de repère, tel qu’un vaisseau sanguin. Déplacez les bras X, Y et Z du deuxième manipulateur pour positionner l’extrémité de l’aiguille d’injection chargée du virus AAV9 dans le site pénétré par la pie.

Ensuite, après avoir inséré la pointe de l’aiguille d’injection à environ 0,5 millimètre dans l’espace sous-pial, utilisez le bras Z pour soulever la pia d’environ 0,3 millimètre, puis utilisez le bras X pour continuer à faire avancer l’aiguille horizontalement dans l’espace sous-pial. Avancez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle pénètre dans l’espace sous-pial à une profondeur d’environ 2 à 3 millimètres.

Ensuite, utilisez la micro-seringue de 50 microlitres pour injecter le virus AAV9-UBI-GFP dans l’espace sous-pial. Retirez l’aiguille d’injection de l’espace sous-pial une fois l’injection de l’AAV9-UBI-GFP terminée. Fermez le muscle et la peau à l’aide d’une suture monofilament fluoré et de clips chirurgicaux. Laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant avant de le loger dans une cage propre.