Visualisation des réseaux neuronaux et vasculaires dans un embryon de poulet

Commencez avec un œuf de poule fécondé fenêtré contenant un embryon à un stade précoce avec son tube neural excisé au niveau des somites un à sept.

Prenez un tube neural de donneur marqué à la GFP d’un embryon de poulet transgénique apparié et implantez-le dans le receveur, en veillant à ce qu’il s’oriente anatomiquement correctement.

Retirez l’excès de liquide autour du greffon pour améliorer l’adhérence entre les tissus du donneur et de l’hôte.

Scellez la fenêtre avec du ruban adhésif transparent pour éviter la déshydratation et la contamination.

Incuber l’ovule jusqu’à ce que l’embryon se développe jusqu’au stade souhaité.

Retirez le ruban adhésif.

Identifiez une veine vitelline sur le jaune qui transporte le sang vers l’embryon et retirez la membrane vitelline sus-jacente.

À l’aide d’une aiguille de verre, injectez régulièrement un colorant fluorescent lipophile dans la veine.

Visualisez l’embryon au microscope à stéréofluorescence.

Le colorant injecté se lie aux cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins, mettant en évidence le réseau vasculaire, tandis que le tube neural marqué à la GFP permet le suivi du réseau neuronal.

Lorsque vous êtes prêt à commencer la procédure de greffe, transférez soigneusement le tube neural disséqué du verre de la montre à l’embryon hôte. Positionnez le tube neural dans la bonne orientation. Et poussez doucement l’explant adjacent dans la région excisée. Si nécessaire, utilisez le micro-scalpel pour couper l’explant à la taille exacte de la région excisée.

Une fois dans la bonne position, retirez le PBS et tout autre liquide pour aider les tissus du donneur et de l’hôte à adhérer et à établir le greffon. L’intégration réussie du tube neural GFP positif greffé dans l’hôte de poulet de type sauvage peut être évaluée au microscope à fluorescence. Scellez toute la fenêtre avec du ruban adhésif transparent de 24 millimètres de large pour éviter la déshydratation et la contamination.

Étiquetez l’embryon chimérique. Et retournez l’œuf dans l’incubateur pour un développement ultérieur.

Au moment expérimental souhaité, récupérez l’œuf de l’incubateur. Et retirez le ruban adhésif transparent pour accéder à l’embryon. Une fois visible, localisez une veine accessible sur le jaune, en vous assurant que le flux sanguin est dirigé vers l’embryon.

Choisissez un point de ramification sur l’une des veines vitellines pour le lieu d’injection. À l’aide d’une pince à épiler, retirez la membrane vitelline au-dessus du point d’injection choisi en la déchirant dans des directions opposées. Ensuite, ajustez le diamètre d’une aiguille de verre tirée à la taille de la veine.

Chargez l’aiguille avec 5 à 10 microlitres de solution DiI. Insérez rapidement l’aiguille dans la veine. Et soufflez régulièrement avec le tube buccal pour permettre au DiI de rejoindre lentement le flux sanguin sans former de caillot. Le succès de l’injection de DiI peut être évalué en observant brièvement l’embryon au microscope à fluorescence.