Imagerie des transitoires calciques rapides dans les terminaisons nerveuses de souris à l’aide de la microscopie confocale

Commencez avec une chambre expérimentale recouverte d’élastomère de silicone contenant un muscle de souris sécurisé positionné sous un microscope confocal.

Le muscle est immergé dans une solution physiologique contenant des inhibiteurs qui bloquent les contractions musculaires.

Le moignon nerveux marqué avec un colorant calcique fluorescent est positionné à l’intérieur de l’électrode d’aspiration, qui est reliée à un stimulateur électrique.

Au niveau de la jonction neuromusculaire, le nerf périphérique est relié au muscle.

Appliquez un stimulus électrique sur le nerf à l’aide de l’électrode. Cela déclenche un afflux rapide d’ions calcium qui se lient au colorant calcique intracellulaire.

Illuminez la jonction neuromusculaire pour exciter le colorant calcique, ce qui le rend fluorescent.

Ensuite, capturez des images haute résolution pour enregistrer les transitoires calciques rapides dans les terminaisons nerveuses périphériques.

Sélectionnez la région d’intérêt et mesurez l’intensité de fluorescence.

Une augmentation rapide de l’intensité de la fluorescence indique un afflux de calcium au niveau des terminaisons nerveuses périphériques, tandis qu’une diminution reflète la clairance du calcium.

Remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer contenant 10 D-tubocurarine micromolaires et allumez la pompe d’aspiration de perfusion pour commencer la perfusion. Dans le logiciel LSCM, choisissez l’électrophysiologie et le mode d’acquisition pour définir les paramètres d’imagerie. Dans les paramètres du menu Job, sélectionnez les paramètres Trigger pour déclencher le stimulateur avec l’impulsion de synchronisation du microscope et réglez le Trigger Out on Frame Field sur le canal OUT 1.

Tournez le mode de balayage sur xyt à une fréquence de balayage de 1 400 Hertz. Le facteur de zoom doit être de 6,1 avec le sténopé complètement ouvert. Assurez-vous que le mode x bidirectionnel de transpassing séquentiel est activé. Réglez ensuite le temps minimum de formation d’une image à 52 millisecondes et collectez les images d’une vidéo brute à 20 images. Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser à argon à 488 nanomètres, avec 8 % de la puissance de sortie.

Lorsque les paramètres sont réglés, appuyez sur le bouton Live Mode pour obtenir un aperçu en direct des terminaisons nerveuses chargées avec le colorant. En mode direct, recherchez la région d’intérêt, ou ROI, pour obtenir la meilleure mise au point, puis décalez le retard sur le stimulateur de 2 millisecondes de moins par rapport à la valeur précédente. Et exécutez le logiciel d’acquisition de données pour acquérir 26 séquences en décalant chaque séquence de deux millisecondes par rapport à la précédente.