Génération Tératome dans la capsule du testicule
7 novembre 2011
Les cellules souches pluripotentes (hPSCs) ont le potentiel pour traiter une myriade de maladies différentes. L'utilité de ces cellules réside dans le fait qu'elles peuvent se différencier en n'importe quel type cellulaire dans le corps. Nous décrivons ici le dosage tératome, qui est utilisé pour démontrer la pluripotence des hPSCs.
L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la pluripotence en générant des tératomes dans la capsule testiculaire de souris immunodéprimées à l'aide de cellules souches pluripotentes humaines ou CSPH. Commencez par récolter une culture des CSPH présumées à tester pour la pluripotence. Ensuite, réalisez une chirurgie afin d'exposer les testicules de la souris et injectez les cellules dans la capsule testiculaire.
Remettre les testicules à leur emplacement d'origine et fermer chirurgicalement le dos de la souris ; après six à douze semaines, examiner la tumeur résultante par histologie afin de détecter la présence de cellules provenant de chacune des trois couches germinales. En fin de compte, les résultats peuvent démontrer qu'une lignée de CESP est véritablement pluripotente en montrant qu'elle est capable de se différencier en cellules issues des trois couches germinales dans une souris immunodéprimée. Bien que de nouvelles méthodes pour démontrer la pluripotence des cellules souches humaines aient été récemment publiées, le test de tératome demeure la méthode de référence dans le domaine. La procédure sera réalisée par Tron, technicienne principale dans mon laboratoire.
Cultiver les cellules souches pluripotentes humaines jusqu'à confluence, puis dissocier les CSPH à l'aide d'Accutase et dénombrer les cellules afin de resuspendre 1 million de CSPH par injection. Commencer par raser l'abdomen de souris mâles âgées de six semaines, anesthésiées et appartenant à une souche de souris immunodéficientes, à l'aide d'un tondeur. Nettoyer la paroi antérieure de l'abdomen de la souris avec une solution de povidone-iodure, en partant du centre de l'abdomen et en progressant dans le sens horaire vers l'extérieur.
Ensuite, lavez la zone rasée avec de l'éthanol à 70 %. Répétez ce processus trois fois, en changeant les compresses à chaque fois. Pour réaliser l'intervention chirurgicale, transférez l'animal sur un tapis chauffant placé à l'intérieur d'une hotte stérile, en utilisant des ciseaux chirurgicaux stériles.
Effectuez une incision longitudinale d’un centimètre à travers la peau et le péritoine juste en dessous du niveau de l’articulation de la hanche tout en maintenant le péritoine avec une pince. Descendez vers la hanche droite à l’aide d’une autre paire de pinces stériles et retirez le tissu adipeux blanc accompagné des testicules attachés. Remplissez ensuite une seringue tuberculinique d’un millilitre avec les hpsc à injecter. Injectez lentement de 20 à 30 microlitres de hpsc au centre de la capsule du testicule, à l’écart de tout vaisseau sanguin important.
Retirer lentement l'aiguille afin d'éviter le reflux des cellules à l'aide de pinces. Replacer les testicules et le tissu adipeux à leur position d'origine dans l'abdomen. Fermer le péritoine avec deux ou trois sutures résorbables et refermer la peau à l'aide de clips auto-fixants.
Après la chirurgie, administrer un analgésique deux fois par jour selon les besoins. Surveiller l'animal pour détecter une croissance tumorale palpable pendant une période de six à douze semaines. Lorsque la taille de la tumeur atteint environ cinq millimètres, prélever la tumeur sur la souris sacrifiée afin de la documenter.
Prendre une photographie de la tumeur et mesurer sa taille et son poids. Ensuite, couper la tumeur en petits morceaux et les fixer dans une solution d'aldéhyde paraformique à 4 % pour l'histopathologie. Généralement, un tératome est observé entre six et douze semaines après.
Dans cet exemple, un million de cellules souches pluripotentes humaines WA oh neuf ont été injectées dans la capsule testiculaire d'une souris immunodéprimée. Un examen approfondi du tératome révèle une hétérogénéité et de nombreux kystes attachés. Comme prévu.
Les analyses histopathologiques indiquent la présence de cellules appartenant aux trois couches germinales. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours inclure une lignée cellulaire témoin positive dont vous savez qu'elle est fortement potente, afin de s'assurer que le test a été correctement effectué. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de déterminer si une lignée de cellules souches humaines est pluripotente ou non.
Aperçu
Cet article traite du test de tératome, une méthode utilisée pour évaluer la pluripotence des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Ce test consiste à injecter des hPSCs dans la capsule du testicule de souris immunodéficientes et à examiner les tératomes résultants afin de détecter leur différenciation en divers types cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Médecine régénérative
- Histopathologie
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent se différencier en tout type cellulaire.
- La formation de tératome est un indicateur clé de la pluripotence.
- Le test est considéré comme la norme de référence pour démontrer la pluripotence.
- De nouvelles méthodes existent, mais le test de tératome reste largement utilisé.
Objectif de l'étude
- Démontrer la pluripotence des CSH humaines par la formation de tératomes.
- Fournir une méthodologie détaillée pour réaliser le test de tératome.
- Mettre en évidence l'importance de l'utilisation d'un contrôle positif dans ce test.
Méthodes utilisées
- Prélèvement des CSH humaines et préparation pour l'injection.
- Exposition chirurgicale du testicule de souris et injection des CSH humaines.
- Surveillance de la croissance tumorale sur une période de six à douze semaines.
- Analyse histologique du tératome pour l'identification de la différenciation des couches germinales.
Résultats principaux
- Des tératomes se sont formés entre six et douze semaines après l'injection.
- L'analyse histopathologique a confirmé la présence de cellules issues des trois couches germinatives.
- A démontré l'efficacité du test de tératome pour évaluer la pluripotence.
- Incluait un contrôle positif afin de valider les résultats du test.
Conclusions
- Le test de tératome est une méthode fiable pour confirmer la pluripotence des CESP.
- Des techniques chirurgicales appropriées et une surveillance rigoureuse sont essentielles pour obtenir des résultats concluants.
- De futures études pourraient explorer des méthodes alternatives parallèlement aux tests traditionnels.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le test de tératome fournit une lecture fonctionnelle de la pluripotence en démontrant la capacité de différenciation dans les trois feuillets germinatifs in vivo. Ce test soutient la validation de la cible et la réduction des risques mécanistiques lors du développement précoce de thérapies basées sur les cellules souches. Il permet d'obtenir une confiance prédictive quant à l'identité cellulaire avant de passer à des modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Confirme la pluripotence en vérifiant la différenciation en lignées ectodermique, mésodermique et endodermique.
- Valeur opérationnelle : Utilise un modèle in vivo standardisé afin de réduire les affirmations faussement positives de pluripotence.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions d'orientation (aller ou ne pas aller) concernant l'adéquation d'une lignée de cellules souches au développement thérapeutique.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des résultats histopathologiques quantitatifs concernant la représentation des feuillets germinatifs.
- Valeur opérationnelle : Établit un protocole reproductible utilisant l'injection dans la capsule du testicule chez des souris immunodéprimées.
- Valeur stratégique : Favorise la standardisation des tests entre laboratoires pour des analyses de pluripotence cohérentes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Valide le potentiel développemental des CSH humaines avant leur différenciation en progéniteurs spécifiques à une lignée.
- Valeur opérationnelle : Nécessite une surveillance sur une période de 6 à 12 semaines pour la formation de tumeurs et une analyse histopathologique.
- Valeur stratégique : Guide l'orientation ajustée au risque des lignées de cellules souches vers des études précliniques d'efficacité.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test de tératome fonctionne comme une étape de sélection dans la continuité de la découverte des cellules souches, située après le maintien de la pluripotence et avant la différenciation dirigée ou les tests d'efficacité préclinique.
- Découverte en biologie : Évalue l'hypothèse fondamentale de la pluripotence en analysant la capacité de différenciation trilinéaire.
- Tri : Génère des taux normalisés de formation de tératomes et des scores histologiques pour l'évaluation comparative de lignées cellulaires.
- Analytique : Fournit des résultats spécifiques aux feuillets germinatifs par histopathologie afin de quantifier le potentiel de différenciation.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la confirmation de la pluripotence et les protocoles de différenciation ultérieurs pour la production de cellules pertinentes dans les maladies.
- Réutilisation en milieu industriel : Sert de point de contrôle de pluripotence réutilisable pour plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes humaines dans le tri des pipelines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique concernant l'identité des cellules souches en confirmant la pluripotence fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats standardisés et reproductibles grâce à des procédures chirurgicales et histologiques définies.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en éliminant précocement les lignées non pluripotentes au cours du développement.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation fondée sur les risques des lignées de cellules souches pour l'investissement dans la différenciation et la modélisation des maladies.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie sur rongeurs et en technique stérile pour l'injection dans la capsule testiculaire.
- Dépend de l'accès à des souches de souris immunodéprimées et à des installations de surveillance postopératoire.
- Suppose la disponibilité d'une infrastructure d'histopathologie pour l'identification des couches germinatives dans les sections de tératomes.
- Implique une surveillance éthique et une approbation par le comité d'éthique (IACUC) concernant l'utilisation animale dans les tests de tumorigénicité.
- Limité par un délai de 6 à 12 semaines, ce qui peut ralentir les campagnes de criblage itératives.
