Analyse de la morphologie dendritique à travers les couches et les colonnes de la drosophile
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:27 min • June 17th, 2025
Commencez avec un cerveau de drosophile éliminé par le glycérol dans un milieu de montage anti-décoloration.
Le cerveau contient des neurones rachidiques disposés en couches, qui organisent les connexions synaptiques, et des colonnes, qui coordonnent les circuits neuronaux.
Quelques-uns de ces neurones sont marqués avec des marqueurs fluorescents verts, contrastant avec les axones photorécepteurs fluorescents rouges.
Positionnez le cerveau face ventrale vers le haut. Placez une lamelle avec de petites plaques d’argile sur les côtés pour éviter d’écraser l’échantillon de cerveau.
Au microscope, obtenez la pile d’images en vue horizontale, contenant le neurone marqué en vert.
Retirez la lamelle et repositionnez le cerveau, côté antérieur vers le haut.
Capturez une pile d’images de la vue frontale du même neurone.
À l’aide du logiciel, combinez ces images, supprimez le canal photorécepteur et visualisez l’image 3D du neurone.
Tracez l’axone, puis les dendrites, en suivant chaque branche jusqu’à sa terminaison, pour cartographier l’organisation dendritique à travers les couches et les colonnes de la moelle.
Pour monter le cerveau dans l’orientation horizontale, transférez un cerveau éliminé au glycérol dans une goutte de 20 microlitres de milieu de montage anti-décoloration, déposée au centre de la lame de microscope. Ensuite, sur une lamelle, fixez de petites plaques d’argile aux quatre coins pour éviter que la lamelle n’écrase le cerveau.
Maintenant, sous un microscope à dissection, positionnez les cerveaux en position ventrale vers le haut. Utilisez la surface dorsale convexe du cerveau comme point de repère pour identifier l’orientation de l’échantillon de cerveau. Cela fournira une vue horizontale du neurone. Fixez ensuite la lamelle.
À l’aide d’un microscope confocal, idéalement équipé de détecteurs GaAsP. Obtenez la pile d’images en vue horizontale avec un objectif à grande ouverture numérique et un zoom numérique de 2,5. Acquérir au moins 180 sections optiques, avoir 512 pixels carrés et une taille de pas de 0,2 micron.
Après avoir pris la première pile d’images, retirez la lamelle de la lame et repositionnez le cerveau en position antérieure vers le haut, ce qui offre une vue frontale. Ensuite, en utilisant la même technique, faites une nouvelle pile d’images de la vue frontale des mêmes neurones imagés dans la vue horizontale. Assurez-vous également de noter l’emplacement du neurone d’intérêt par rapport au neuropille rachidien.
L’identification des mêmes neurones est réalisable sous un grossissement plus faible. Cependant, si le signal est perdu parce que le tissu est profond, il suffit d’imager la moitié ventrale du cerveau.
Le but de cette procédure est de tracer les neurites et d’attribuer des points de référence pour l’enregistrement. Tout d’abord, ouvrez le fichier image recombiné. Ensuite, allez dans Modifier, puis Afficher le réglage de l’affichage, et désactivez le canal du photorécepteur, qui est rouge.
Ensuite, visualisez l’image en mode surpass. Si l’ordinateur est équipé du système stéréographique, activez la stéréo et utilisez le mode Quad Buffer pour visualiser les images 3D. Ajoutez de nouveaux filaments. Allez dans Surpass, puis Filaments. Et cliquez sur l’onglet intitulé « Sauter la création automatique, modifier manuellement ». Cliquez ensuite sur l’onglet Dessiner et sélectionnez Profondeur automatique.
Ensuite, sélectionnez Paramètres. Basculez l’option Ligne et entrez le numéro de pixel approprié pour une meilleure visualisation. Basculez ensuite l’option Afficher les dendrites, le point de départ et le point de branchement, puis définissez la qualité de rendu sur 100 %. Sélectionnez maintenant l’onglet Dessiner et commencez à tracer les neurites. Commencez par l’axone, puis passez aux dendrites. L’axone et les dendrites des neurones transmédullaires devraient être faciles à différencier.
Après avoir tracé les neurites, revenez aux paramètres et débasculez le point de départ et le point de branchement. Allez ensuite dans Surpass, puis Exporter. Sélectionnez des objets et enregistrez le filament dans un fichier Inventor.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'imagerie des neurones du cerveau de Drosophile à l'aide de la microscopie confocale. L'accent est mis sur la visualisation et le traçage de l'organisation des neurones de la mésoglace et de leurs connexions synaptiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques d'imagerie
- Cartographie neuronale
Contexte
- Drosophila sert de modèle pour l'étude des circuits neuronaux.
- Les neurones de la mésocéphale sont essentiels pour comprendre l'organisation synaptique.
- Les marqueurs fluorescents permettent de visualiser des structures neuronales spécifiques.
- Les techniques d'imagerie 3D améliorent la compréhension de la morphologie neuronale.
Objectif de l'étude
- Visualiser et tracer l'organisation des neurones de la médullo.
- Cartographier les structures dendritiques et les connexions synaptiques.
- Améliorer les techniques d'imagerie pour une analyse neuronale plus précise.
Méthodes utilisées
- Préparation de cerveaux de Drosophila clarifiés au glycérol.
- Utilisation de la microscopie confocale pour l'imagerie.
- Acquisition de coupes d'images en vue horizontale et en vue frontale.
- Reconstruction 3D et traçage des structures neuronales.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des neurones de la moelle en 3D.
- Cartographie détaillée des axones et des dendrites.
- Identification de l'organisation synaptique à travers les couches.
- Techniques de visualisation améliorées pour l'analyse neuronale.
Conclusions
- La méthode fournit un cadre solide pour l'imagerie neuronale.
- La visualisation 3D aide à comprendre les circuits neuronaux complexes.
- Cette approche peut être appliquée à d'autres études neuronales.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
Cette méthode permet une visualisation 3D à haute résolution de la morphologie neuronale dans un système modèle génétiquement modifiable, en appuyant la validation de cibles grâce à une cartographie détaillée de la structure des circuits neuronaux. En fournissant des données morphologiques quantitatives à travers des couches et des colonnes anatomiques définies, elle améliore la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte en précisant les relations structure-fonction. L'approche renforce la confiance prédictive dans le choix des cibles en reliant l'organisation dendritique aux schémas de connectivité synaptique pertinents pour les modèles de maladies neuropsychiatriques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en cartographiant l'organisation dendritique à travers les couches et colonnes de la médulla dans un système pertinent pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie et de traçage standardisés pour un phénotypage morphologique cohérent dans différentes conditions expérimentales.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives sur la morphologie dendritique, adaptées au développement d'essais dans le cadre de campagnes de criblage phénotypique.
- Valeur opérationnelle : Produit des reconstructions 3D reproductibles permettant d'évaluer de manière fiable l'effet de composés sur la structure neuronale.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Soutient l'alignement translationnel des biomarqueurs en corrélant les modifications structurelles des dendrites avec des altérations fonctionnelles des circuits neuronaux.
- Valeur opérationnelle : Facilite la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en fournissant une plateforme normalisée de phénotypage neuronal.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la chaîne de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification du composé candidat, en fournissant des données de phénotypage structural qui éclairent la compréhension des mécanismes et la modélisation prédictive.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en permettant une cartographie détaillée de l'arborisation dendritique à travers des couches et colonnes neuronales définies.
- Triage : Fournit des données morphologiques quantitatives prêtes à l'analyse, permettant un triage fiable de composés et une analyse des relations structure-activité.
- Analytique : Génère des données traçables sur les neurites et des métriques de ramification qui aident les équipes à comparer les phénotypes structuraux dans différentes conditions génétiques ou pharmacologiques.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en fournissant des phénotypes structuraux pertinents pour la maladie, corrélés à des biomarqueurs de dysfonction synaptique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité d'imagerie et de traçage réutilisable, applicable à plusieurs cibles neuronales et modèles de maladies dans la découverte en neurosciences.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à la visualisation directe de l'organisation dendritique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité de l'évaluation de la morphologie neuronale entre laboratoires et au fil du temps.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données de phénotypage structural permettant de réduire les risques liés aux cibles dès les premières étapes du processus de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des données quantitatives de morphologie dendritique associées à la fonction des circuits.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en neuroanatomie de Drosophila, en microscopie confocale et en logiciels de reconstruction d'images 3D.
- Exige un microscope confocal équipé d'un objectif à haute ouverture numérique, de détecteurs GaAsP et d'une capacité d'acquisition de z-stacks.
- Implique une standardisation des protocoles de préparation, de montage et d'imagerie des cerveaux entre utilisateurs pour des résultats cohérents.
- Suppose des adaptations lors de l'application de la technique à différents sous-types neuronaux ou stades de développement.
- Est limité par la nécessité d'un marquage fluorescent et par les contraintes de profondeur de pénétration de la microscopie confocale dans les tissus intacts.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026