Isolement et purification de glycoprotéines d’oligodendrocytes de myéline recombinante
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:59 min • August 7th, 2025
MOGtag est une glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline recombinante fusionnée avec des marqueurs de solubilisation et de purification pour les études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune.
Pour isoler MOGtag, suspendez les cellules bactériennes exprimant MOGtag dans un tampon de lyse et incubez.
Les enzymes et les détergents contenus dans le tampon perturbent les lipides membranaires et dégradent la paroi cellulaire.
Sonicate pour lyser davantage les cellules, libérant des corps d’inclusion insolubles contenant MOGtag.
Centrifugeuse pour granuler les corps d’inclusion. Jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans le tampon et incuberez.
Ajouter le chlorhydrate de guanidine, puis incuber pour solubiliser le MOGtag.
Transférez les protéines solubles sur une résine de nickel chargée, mélangez et incubez en secouant pour permettre au MOGtag de se lier aux ions nickel.
Centrifugeuse pour granuler le MOGtag lié. Retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un tampon d’élution et incubez en secouant.
L’imidazole dans le tampon d’élution libère le MOGtag de la résine.
Centrifugez à nouveau, récupérez le surnageant purifié contenant du MOGtag et stockez-le pour une analyse plus approfondie.
Répartissez uniformément les cultures entre des bouteilles de 250 millilitres compatibles avec la centrifugation à grande vitesse, et gardez les bouteilles sur de la glace à partir de ce moment. Granulez les cellules bactériennes à 22 000 * g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Remettez en suspension et combinez toutes les pastilles bactériennes dans un total de 30 millilitres de tampon de lyse. Transférez ce volume dans un tube à fond rond de 50 millilitres capable d’une centrifugation à grande vitesse.
Placez ce tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant le temps d’incubation, secouez deux fois le tube pour remettre les cellules en suspension. Après l’incubation, transférez le tube sur de la glace et sonicez la solution à 20 kilohertz et à une amplitude de 70 %, en pulsant pendant trois secondes et en l’arrêtant pendant trois secondes pendant 5 impulsions. Sonicez la solution pendant six cycles au total de cinq impulsions, en laissant la solution refroidir sur la glace entre les tours.
Ensuite, centrifugez la solution à 24 000 * g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius, puis remettez la pastille en suspension dans 30 millilitres de tampon A et incubez la solution à 4 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, ajoutez 17,2 grammes de guanidine-HCl à la solution. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant une heure pour solubiliser la protéine de marquage MOG. Pour purifier la protéine de marquage MOG, transférez tout le volume de protéine solubilisée dans le premier tube contenant de la résine de nickel. Après avoir mélangé, placez le tube horizontalement sur une bascule à 4 degrés Celsius pendant une heure.
Après avoir centrifugé le tube à 4 500 * g pendant huit minutes à 4 degrés Celsius, transférez le surnageant dans le deuxième tube de résine de nickel et incubez comme précédemment. Pendant ce temps, remettez en suspension la résine de nickel dans le premier tube dans 40 millilitres de tampon d’élution et placez le tube horizontalement sur une bascule à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de centrifuger comme précédemment. Transférez le surnageant contenant la protéine de marquage MOG éluée dans une bouteille de 250 millilitres étiquetée protéine de marquage MOG purifiée. Conservez cette bouteille à 4 degrés Celsius.
Aperçu
Cet article décrit le processus de purification de MOGtag, une protéine recombinante de la glycoprotéine myélinique oligodendrocytaire, essentielle pour les études d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. La méthodologie comprend la lyse bactérienne, la solubilisation et des techniques de purification afin d'isoler MOGtag pour des analyses ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Purification des protéines
- Recherche sur les maladies auto-immunes
Contexte
- MOGtag est essentiel pour l'étude des maladies auto-immunes liées à la myéline.
- Comprendre sa purification contribue à la reproductibilité expérimentale.
- Le processus implique diverses techniques biochimiques.
- Les recherches sur MOGtag apportent des connaissances sur les affections démyélinisantes.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'isolement de MOGtag.
- Approfondir la compréhension du glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline dans la recherche.
- Fournir un protocole pouvant être reproduit dans d'autres laboratoires.
Méthodes utilisées
- Suspension des cellules bactériennes dans un tampon de lyse.
- Sonication pour lyser les cellules et libérer les corps d'inclusion.
- Centrifugation pour isoler les culots contenant MOGtag.
- Utilisation d'une résine au nickel pour la fixation et la purification des protéines.
Résultats principaux
- Isolation réussie de MOGtag à partir de cellules bactériennes.
- Pureté élevée de MOGtag obtenue grâce aux procédés d'élution.
- Le protocole a démontré une reproductibilité entre les essais.
- Le MOGtag purifié a été stocké pour des utilisations expérimentales futures.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour la purification de MOGtag.
- Les résultats soutiennent des recherches supplémentaires sur l'encéphalomyélite auto-immune.
- Ce protocole peut faciliter les études sur les maladies liées à la myéline.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La purification du MOGtag recombinant permet la production standardisée d'antigènes pertinents pour la recherche sur la démyélinisation auto-immune. Un accès fiable au MOGtag purifié soutient l'analyse mécanistique et la validation ciblée dans les modèles précliniques de la sclérose en plaques. Cette capacité fonde la continuité translationnelle, depuis la découverte jusqu'à la validation in vivo, dans les flux de travail de neurobiologie auto-immune.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de l'auto-immunité médiée par les lymphocytes B à l'aide d'antigènes recombinants définis.
- Permet la validation fonctionnelle des réponses immunitaires dirigées contre la myéline dans les modèles de maladie.
- Facilite la détection mécanistique des risques en fournissant un matériel antigénique constant pour la vérification des hypothèses.
Développement de criblages et de tests
- Permet d'obtenir une protéine purifiée reproductible pour la normalisation des dosages et les flux de travail de criblage en aval.
- Permet une évaluation quantitative des réponses immunitaires dans des systèmes biologiques validés.
- Facilite l'extensibilité et la réutilisation sur plusieurs plates-formes expérimentales.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie afin de faciliter la découverte translationnelle de biomarqueurs en neuroimmunologie.
- Garantit une continuité allant de la production de l'antigène aux études d'efficacité in vivo et aux analyses mécanistiques.
- Réduit la variabilité biologique dans la recherche préclinique sur l'encéphalomyélite auto-immune.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le protocole de purification MOGtag s'intègre à l'interface entre la production d'antigènes et le développement de modèles précliniques, en soutenant les flux de travail depuis la découverte précoce jusqu'à la validation translationnelle.
- Biologie de la découverte : Fournit un antigène de haute qualité pour des études sur la réponse immunitaire fondées sur des hypothèses.
- Essais de dépistage : Permet le développement d'essais reproductibles et le profilage immunitaire quantitatif.
- Analytique : Fournit une protéine purifiée destinée à des analyses biochimiques et immunologiques ultérieures.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la production d'antigène et la validation dans des modèles in vivo pour l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Un protocole standardisé favorise la reproductibilité entre les études et les équipes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles auto-immunes et les études mécanistiques.
- Valeur opérationnelle : Assure une purification protéique standardisée et évolutible pour des résultats expérimentaux reproductibles.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques en phase avancée en garantissant la qualité et la reproductibilité de l'antigène.
- Impact sur le portefeuille : Permet la progression ajustée au risque des actifs et modèles en neuro-immunologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les protocoles d'expression et de purification de protéines recombinantes.
- Suppose l'accès à une infrastructure de centrifugation à grande vitesse, de sonication et de chromatographie d'affinité.
- Exige une standardisation rigoureuse entre équipes pour assurer la reproductibilité entre les études.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les constructions d'antigènes ou les systèmes hôtes utilisés.
- Le rendement protéique et la solubilité peuvent varier selon les conditions d'expression et la conception de la construction.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026