Fabrication de dispositifs en PDMS et modification de surface

Je m’appelle Ken Kotz. Je suis post-doctorant ici au Bio MAs Resource Center affilié au Massachusetts General Hospital. Mon principal projet de recherche consiste à isoler les neutrophiles à l’aide d’un dispositif de capture d’immuno-affinité avec des structures microfluidiques.

Nous utilisons ce dispositif dans cinq hôpitaux différents à travers le pays pour isoler l’ARN pour l’analyse génomique en aval. En gros, ce que vous avez est un maître de SU huit résine photo sur du silicium. Nous allons verser un élastomère A-P-D-M-S en deux parties sur ce master et ce PDMS formera un moule.

Nous retirons le moule maître de son boîtier et le plaçons dans une boîte de Pétri. Le master est fixé par du ruban adhésif au fond d’une boîte de Pétri. Sur la balance, nous pesons un mélange de PDMS, de durcisseur et de résine de base.

Le rapport est d’une partie de durcisseur pour 10 parties de résine. En règle générale, pour nos appareils qui ont été découpés, nous pesons respectivement 20 à 30 grammes de résine et deux à trois grammes de durcisseur. Après avoir versé à la fois le durcisseur et la résine dans le petit bateau de lactosérum, nous utilisons une fourchette en plastique standard pour mélanger les deux ensemble.

Vous voulez vous assurer de mélanger vigoureusement et de plier le mélange les uns sur les autres pour vous assurer que le durcisseur est uniformément réparti dans la résine. En règle générale, nous surveillons la qualité du mélange des deux. En regardant le nombre de bulles d’air, nous essayons d’obtenir une répartition uniforme des petites bulles d’air dans tout l’élastomère.

Nous versons ensuite le PDMS sur le maître SU eight qui se trouve dans la boîte de Pétri. Nous plaçons le maître avec le PDMS dessus dans une cloche à vide, et évacuons la chambre pour dégazer l’air que nous y avons mélangé. En règle générale, le processus de dégazage prend de 30 minutes à une heure.

Après le dégazage, nous retirons les appareils de la chambre à vide et les plaçons dans un four à 65 à 80 degrés C. Le temps minimum de durcissement à ces températures est de trois à six heures. Dans notre laboratoire, nous laissons généralement les appareils dans le four pendant la nuit.

En règle générale, nous utilisons un couteau en acier chirurgical numéro 11. Nous faisons des coupes droites à environ un demi-centimètre du bord du maître en silicium, et nous coupons autour du bord du maître pour faire un grand disque. Nous décollons le moule PDMS du maître et nous plaçons la caractéristique côté vers le haut dans une boîte de Pétri propre.

Nous sortons le moule libéré de la boîte de Pétri et nous le plaçons sur une surface de coupe à l’aide d’un couteau ou d’un couteau monté sur un rail linéaire. Nous sectionnons les appareils qui sont contenus sur le moule. Chaque dispositif de section est ensuite remis dans la boîte de Pétri pour un traitement ultérieur.

En règle générale, pour interfacer nos appareils avec des fluides, nous perçons des trous dans le dispositif PDMS. L’appareil que nous utilisons pour percer des trous est une seringue standard à trois moulins. À l’extrémité de la seringue à trois moulins se trouve une aiguille en acier inoxydable à pointe émoussée.

À l’intérieur de l’aiguille en acier inoxydable se trouve un fil qui s’adapte au diamètre intérieur de l’aiguille. Ce fil est attaché au piston de la seringue En tirant sur le piston et en rétractant cette aiguille, vous pouvez percer un trou ou percer un bouchon dans le PDMS. Retournez l’appareil PDMS et éjectez-le en appuyant sur le piston.

Le secret des dispositifs de poinçonnage est de garder le piston aussi vertical que possible et de ne pas faire pivoter le dispositif de poinçonnage. Lorsque vous enfoncez le PDMS, vous soulevez l’ensemble de l’appareil, l’ensemble de l’appareil PDMS avec une pince à épiler, le retournez et éjectez la prise en appuyant sur le piston. Vous saisissez le bouchon avec une pince à épiler et vous vous en débarrassez.

Ensuite, vous rétractez à nouveau le piston, retournez l’appareil vers le bas et retirez l’appareil de coupe. Vous répétez cette opération jusqu’à ce que vous ayez tous vos trous perforés. Ainsi, pour le processus de collage, nous collons nos dispositifs PDMS à des lames de verre.

Pour nos appareils, nous allons lier ou fixer de manière non réversible le PDMS à des lames de verre. La façon d’y parvenir est de les placer dans un, de les placer dans un Asher à plasma et de les exposer à un plasma d’oxygène réactif. Pour ce faire, les étapes consistent donc à prendre le dispositif PDMS et à le placer sur le plateau de l’Asher plasma.

Avec les caractéristiques de l’appareil orientées vers le haut, vous pouvez utiliser n’importe quelle lame de microscope en verre standard. Nous utilisons une lame de microscope légèrement agrandie d’un pouce et demi pour s’adapter à notre appareil. Vous pouvez les utiliser dès la sortie de l’emballage.

Nous préférons les traiter dans une solution de piranha. Cela nettoie tous les contaminants organiques qui pourraient se trouver à la surface de la lame de verre. Après avoir placé l’appareil et la lame de verre sur le plateau pour l’Asher plasma, vous glissez le plateau dans l’Asher plasma et l’exposez au plasma d’oxygène réactif.

Après avoir terminé le programme de l’Asher plasma, nous ouvrons la chambre et nous retirons la plaque avec nos appareils sur la paillasse. À l’aide d’une pince à épiler, nous soulevons soigneusement l’appareil PDMS, en faisant attention de ne pas toucher les surfaces de liaison avec nos doigts. Nous retournons le côté de liaison sur le verre, sur la lame de verre, puis nous nous assurons qu’il n’y a pas de bulles d’air entre le PDMS et la lame de verre.

Nous plaçons le dispositif PDMS maintenant collé au verre sur un, sur une plaque chauffante à 65 à 75 degrés C pendant 10 minutes pour obtenir une meilleure liaison chimique. Donc, cette partie, dans cette section, nous allons modifier chimiquement les surfaces du PDMS dans le verre après le collage en salle blanche, nous nous retrouvons avec une surface PMS de surface A qui a des groupes OL réactifs sur, sur la surface. Nous avons besoin que cette surface réactive soit hydrophile et finisse par se diffuser dans la majeure partie du PMS.

Ainsi, la chimie de surface est mieux accomplie immédiatement après le traitement au plasma, nous allons utiliser une solution à 5 % d’un me capto. C’est un trois me capto, propyl, trimeth oxy. Il s’agit d’une solution à 5 % en volume, et en gros, ce que nous faisons, c’est que nous l’injectons dans l’entrée et nous nous assurons que vous remplissez complètement l’appareil sans aucune bulle d’air.

S’il y a des bulles d’air, vous les poussez avec une pince à épiler. Une fois que vous avez injecté le slan, vous le laissez reposer pendant 15 à 30 minutes. À température ambiante, nous injectons généralement un deuxième volume de slan 10 minutes dans la réaction.

Donc, après que le cylin a réagi pendant environ une demi-heure, nous prendrons un, nous rincerons tous les appareils avec trois à quatre volumes d’éthanol pur. L’excédent que nous éjectons sera simplement essuyé avec une lingette chimique Après le rinçage des appareils, nous ramassons les appareils et les plaçons sur une plaque chauffante, réglée à cent degrés C, et nous permettrons essentiellement à l’éthanol qui s’y trouve de s’évaporer. Cela aide à agenouiller la surface de repos.

Une fois que l’appareil est sec, il peut être stocké dans un appareil desséché pendant des mois ou il peut, vous pouvez prendre l’appareil et passer immédiatement à l’étape suivante. Une fois que les appareils ont durci, ils ont durci avec un revêtement sinusoïdal sur le verre et la surface PDMS. Le sinus est un sinus a capto avec le groupe thiol, qui va réagir avec notre réticulant hétéro bifonctionnel, qui est GMBS.

Il est dilué dans de l’éthanol pur. Il est réactif à l’eau, vous devez donc faire attention à ne pas l’exposer à des conditions aqueuses. Nous l’injectons dans les appareils et nous enlevons toutes les bulles d’air à l’aide d’une pince à épiler comme je le fais ici pour m’assurer que toutes les surfaces sont mariées à cette molécule.

On le couvre et on le laisse réagir pendant une demi-heure. Après que le GMBS ait réagi pendant une demi-heure, nous allons rincer les appareils avec de l’eau déminéralisée pour éliminer toute trace d’éthanol qui se trouve dans l’appareil. Ensuite, nous allons passer par le neu travain, qui est une protéine de liaison à la biotine.

Le neu travain est ensuite pré-dilué à une concentration de 10 microgrammes par mil. Si, si de l’air est accidentellement injecté dans l’appareil, l’appareil devra être rincé à l’éthanol pour éliminer efficacement tout l’air humide d’éthanol, l’appareil fait mieux surface et vous permet d’éliminer toutes les bulles d’air qui ont été accidentellement introduites dans l’appareil. Et une fois que les appareils ont été rincés avec de l’eau ionisée, nous remplissons généralement l’appareil avec deux à quatre volumes de la solution de travain T neutre diluée.

Le Nutt travain réagira avec le GMBS, qui est immobilisé à la surface par tout moyen primaire sur le Nutt travain. Ce processus peut se produire à température ambiante pendant une heure. En règle générale, je place les appareils dans la chambre froide à quatre degrés C pendant la nuit.

Avant d’ajouter l’anticorps, cependant, nous voulons éliminer tout Aden, qui n’est pas lié en solution. Et nous le faisons en faisant couler à travers 1 % de BSA en solution diluée dans du PBS. Étant donné que ces puces vont être utilisées pour l’analyse génomique en aval, toutes les solutions que nous utilisons sont exemptes d’ARN.

En règle générale, nous rinçons l’appareil avec quatre à cinq volumes de la solution BSA à 1 %. Ensuite, nous ajoutons notre anticorps. L’anticorps de cette expérience est le CD 66 B et des anticorps spécifiques aux granulocytes dans le sang total.

Nous utilisons une concentration de 10 à 25 microgrammes par mil, et nous injectons l’anticorps. Nous injecterons 200 microlitres d’anticorps dans chaque appareil. Nous allons faire deux injections d’une centaine de microlitres, une dans chaque port de l’appareil.

En règle générale, nous injectons cent microlitres dans un orifice, et nous attendons 30 minutes et injectons cent microlitres supplémentaires dans l’orifice opposé.