Fabrication de dispositifs en PDMS et modification de surface

Je m'appelle Ken Kotz. Je suis postdoctorant au centre de ressources Bio MAs affilié à l'hôpital général du Massachusetts. Mon projet de recherche principal consiste à isoler des neutrophiles à l'aide d'un dispositif de capture par affinité immunitaire doté de structures microfluidiques.

Nous utilisons cet appareil dans cinq hôpitaux différents à travers le pays afin d'isoler l'ARN destiné à des analyses génomiques en aval. Fondamentalement, on dispose d'un master en résine photosensible SU-8 déposée sur du silicium. Nous allons verser un élastomère en deux parties, A-P-D-M-S, sur ce master, et le PDMS formera un moule.

Nous retirons le moule maître de son boîtier et le plaçons dans une boîte de Pétri. Le moule maître est fixé par du ruban adhésif sur le fond de la boîte de Pétri. Sur la balance, nous pesons un mélange de PDMS, d'agent durcisseur et de résine de base.

Le rapport est d'une partie de durcisseur pour dix parties de résine. Généralement, pour nos dispositifs découpés, nous pesons entre 20 et 30 grammes de résine et respectivement entre deux et trois grammes de durcisseur. Après avoir versé le durcisseur et la résine dans le petit bac en plastique, nous utilisons une fourchette en plastique standard pour mélanger les deux composants.

Vous devez vous assurer de bien mélanger vigoureusement et de replier le mélange sur lui-même afin de garantir une répartition uniforme du durcisseur dans la résine. Généralement, nous surveillons la qualité du mélange des deux composants. En observant le nombre de bulles d'air, nous cherchons à obtenir une répartition homogène de petites bulles d'air dans tout l'élastomère.

Nous versons ensuite le PDMS sur le moule SU huit placé dans la boîte de Pétri. Nous plaçons le moule avec le PDMS au-dessus dans un enceinte à vide munie d'un cloche, puis nous faisons le vide dans la chambre afin d'éliminer l'air que nous avons incorporé. Généralement, le processus de dégazage prend de 30 minutes à une heure.

Après dégazage, nous retirons les dispositifs de la chambre à vide et les plaçons dans un four à une température de 65 à 80 degrés C. Le temps de durcissement minimal à ces températures est de trois à six heures. Dans notre laboratoire, nous laissons généralement les dispositifs dans le four toute la nuit.

Typiquement, nous utilisons un scalpel en acier chirurgical de numéro 11. Nous effectuons des incisions droites d’environ un demi-centimètre à partir du bord du moule en silicium, en découpant tout autour du bord du moule pour former un grand disque. Nous détachons le moule en PDMS du moule maître et nous le plaçons, côté motifs vers le haut, dans une boîte de Pétri propre.

Nous retirons le moule libéré de la boîte de Pétri et nous le plaçons sur une surface de coupe à l’aide d’un couteau ou d’un couteau monté sur un rail linéaire. Nous découpons les dispositifs contenus sur le moule. Chaque dispositif sectionné est ensuite replacé dans la boîte de Pétri pour un traitement ultérieur.

Typiquement, pour connecter nos dispositifs aux fluides, nous perforons des trous dans le dispositif en PDMS. Le dispositif que nous utilisons pour percer des trous est une seringue standard de trois millimètres. À l'extrémité de la seringue de trois millimètres se trouve une aiguille en acier inoxydable à bout émoussi.

À l'intérieur de l'aiguille en acier inoxydable se trouve un fil qui correspond au diamètre intérieur de l'aiguille. Ce fil est fixé au piston de la seringue. En tirant sur le piston et en retirant l'aiguille, vous pouvez percer un trou ou extraire un bouchon dans le PDMS. Retournez le dispositif en PDMS et expulsez-le en appuyant sur le piston.

Le secret pour utiliser les appareils de perforation consiste à maintenir le piston aussi vertical que possible et à ne pas du tout faire tourner l'appareil de perforation. Lorsque vous percez le PDMS, vous soulevez l'ensemble de l'appareil, tout le dispositif en PDMS, à l'aide d'une pince, vous le retournez et vous expulsez le bouchon en appuyant sur le piston. Vous saisissez le bouchon avec une pince et vous le jetez.

Ensuite, vous retirez à nouveau le piston, retournez l'appareil vers le bas et retirez l'outil de découpe. Vous répétez cette opération jusqu'à ce que tous vos trous soient perforés. Pour le processus d'assemblage, nous fixons nos dispositifs en PDMS sur des lamelles de verre.

Pour nos dispositifs, nous allons lier de façon non réversible ou fixer de manière covalente le PDMS sur des lames de verre. Cette opération s'effectue en les plaçant dans un nettoyeur à plasma et en les exposant à un plasma d'oxygène réactif. Les étapes à suivre consistent donc à prendre le dispositif en PDMS et à le placer sur le plateau du nettoyeur à plasma.

Avec les composants du dispositif orientés vers le haut, vous pouvez utiliser une lame de microscope en verre standard. Nous utilisons une lame de microscope légèrement agrandie d'un pouce et demi afin qu'elle s'adapte à notre dispositif. Vous pouvez les utiliser directement sorties de l'emballage.

Nous préférons les traiter dans une solution de piranha. Cela élimine tous les contaminants organiques qui pourraient être présents à la surface de la lame de verre. Après avoir placé le dispositif et la lame de verre sur le plateau de l'ashureuse à plasma, vous insérez le plateau dans l'ashureuse à plasma et l'exposez au plasma d'oxygène réactif.

Après avoir terminé le programme du plasma Asher, nous ouvrons la chambre et retirons la plaque contenant nos dispositifs sur le plan de travail. À l'aide de pinces, nous soulevons délicatement le dispositif en PDMS, en prenant soin de ne pas toucher les surfaces de collage avec les doigts. Nous retournons la face de collage sur le verre, sur la lame de verre, puis nous nous assurons qu'il n'y a aucune bulle d'air entre le PDMS et la lame de verre.

Nous plaçons le dispositif en PDMS, maintenant lié au verre, sur une plaque chauffante à 65 à 75 degrés C pendant 10 minutes afin d'obtenir une liaison chimique plus forte. Dans cette partie, dans cette section, nous allons modifier chimiquement les surfaces du PDMS et du verre après le collage en salle blanche. Nous obtenons ainsi une surface de PDMS présentant des groupes OL réactifs à la surface. Cette surface réactive est hydrophile et finira par diffuser vers l'intérieur du volume du PDMS.

Ainsi, la chimie de surface est optimale immédiatement après le traitement au plasma. Nous allons utiliser une solution à 5 % d’un mercapto. Il s’agit d’un tris-mercapto, propyle, triméthoxy. Cette solution est à 5 % en volume. Fondamentalement, nous l’injectons dans l’entrée et nous assurons de remplir complètement le dispositif sans aucune bulle d’air.

S'il y a des bulles d'air, vous les retirez à l'aide de pinces. Une fois cela fait, après avoir injecté le slan, vous laissez reposer pendant 15 à 30 minutes. À température ambiante, nous injectons généralement un second volume de slan 10 minutes après le début de la réaction.

Après environ une demi-heure de réaction du cylin, nous allons rincer tous les dispositifs avec trois à quatre volumes de dispositif d'éthanol pur. L'excès éjecté sera simplement essuyé avec un chiffon chimique. Après le rinçage des dispositifs, nous les prélevons et les plaçons sur une plaque chauffante réglée à cent degrés C, et nous laissons s'évaporer l'éthanol présent à l'intérieur. Ceci permet de neutraliser la surface silanée.

Une fois l'appareil séché, il peut être conservé dans un environnement desséchant pendant plusieurs mois ou bien vous pouvez prendre l'appareil et passer immédiatement à l'étape suivante. Après que les dispositifs aient polymérisé, ils présentent désormais un revêtement de silane sur les surfaces en verre et en PDMS. Le silane est un silane aminopropyltrihydrosilane portant un groupe thiol, qui réagira avec notre agent de réticulation hétérobifonctionnel, le GMBS.

Il est dilué dans de l'éthanol pur. Il réagit avec l'eau, il faut donc prendre soin de ne pas l'exposer à des conditions aqueuses. Nous l'injectons dans les dispositifs et nous éliminons toute bulle d'air à l'aide de pinces, comme je le fais ici, afin de s'assurer que toutes les surfaces soient recouvertes par cette molécule.

Nous le couvrons et laissons réagir pendant une demi-heure. Une fois que le GMBS a réagi pendant une demi-heure, nous allons rincer les dispositifs avec de l’eau déionisée afin d’éliminer toute trace d’éthanol présente dans le dispositif. Ensuite, nous ferons circuler du neu travain, qui est une protéine de liaison à la biotine.

Le neu travain est ensuite prédilué à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. S'il arrive par erreur que de l'air soit injecté dans le dispositif, celui-ci devra être récuré à l'éthanol afin d'éliminer efficacement tout l'air. L'éthanol mouille mieux les surfaces du dispositif et permet d'éliminer toutes les bulles d'air introduites accidentellement. Une fois que les dispositifs ont été rincés avec de l'eau ionisée, on remplit généralement le dispositif avec deux à quatre volumes du dispositif de la solution diluée de neu travain neutre.

Le Nutt travain réagira avec le GMBS, qui est immobilisé à la surface par tout moyen primaire sur le Nutt travain. Ce processus peut avoir lieu à température ambiante pendant une heure. Généralement, je place les dispositifs dans la chambre froide à quatre degrés C toute la nuit.

Avant d'ajouter l'anticorps, nous voulons toutefois éliminer tout Aden non lié en solution. Nous procédons en faisant circuler une solution de BSA à 1 % diluée dans du PBS. Étant donné que ces puces seront utilisées pour des analyses génomiques en aval, toutes les solutions que nous utilisons sont exemptes d'ARN.

Typiquement, nous rincerons l'appareil avec quatre à cinq volumes de la solution de BSA à 1 %. Puis, après cela, nous ajoutons notre anticorps. L'anticorps utilisé pour cette expérience est le CD 66 B et des anticorps spécifiques aux granulocytes dans le sang total.

Nous utilisons une concentration comprise entre 10 et 25 microgrammes par millilitre, et nous injecterons l'anticorps. Nous injecterons 200 microlitres d'anticorps dans chaque dispositif. Nous effectuerons deux injections de cent microlitres, une dans chaque orifice du dispositif.

Typiquement, nous injecterons cent microlitres dans un orifice, puis attendrons 30 minutes avant d'injecter cent microlitres supplémentaires dans l'orifice opposé.