Quantification des épines dendritiques à l’aide de l’imagerie par microscopie confocale

Prenez des neurones pyramidaux qui sont transduits et immunomarqués en vert fluorescent.

Acquérez des images des neurones à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser dont les paramètres sont ajustés pour assurer une qualité d’image optimale.

Ouvrez une image à l’aide d’un logiciel spécialisé et utilisez le filtre gaussien pour réduire le bruit de fond.

Effectuez un traçage semi-automatique des dendrites en estimant d’abord le diamètre des dendrites. Ensuite, sélectionnez le point de départ, le chemin d’accès et l’extrémité de la dendrite.

Pour la segmentation automatisée du spine, sélectionnez reconstruire le diamètre de la dendrite et définir le seuil de volume de dendrite pour représenter le volume de dendrite réel.

Spécifiez des valeurs pour le plus petit diamètre de tête de colonne vertébrale et la longueur maximale de la colonne vertébrale.

Ajustez le seuil des points représentant les épines, en veillant à ce qu’ils soient localisés sur les têtes réelles des épines.

Définissez des paramètres pour classer les épines en fonction de la longueur, du diamètre de la tête et de la forme.

Générez un modèle 3D de la dendrite avec des épines et exportez les données pour une analyse plus approfondie.

Sous un microscope confocal, sélectionnez au moins 10 neurones sains par condition avec une morphologie pyramidale et une arborisation dendritique complète. Pour quantifier 60 à 100 micromètres par dendrite, acquérez des images avec un objectif à huile 40x, NA 1.3 et un laser de 488 nanomètres avec une puissance de crête typique au niveau de l’échantillon d’environ 20 microwatts.

Réglez la taille des pixels autour de 80 nanomètres pour échantillonner correctement les épines dendritiques. Pour échantillonner l’ensemble du volume neuronal, acquérez une pile Z avec un espacement z de 150 à 300 nanomètres, ce qui donne 20 à 30 tranches z. Pour effectuer une quantification 3D des épines dendritiques, utilisez les paramètres suivants pour le logiciel d’analyse.

Pour le prétraitement, utilisez le filtrage gaussien en choisissant Traitement d’image, Lissage, Filtre gaussien. Définissez la largeur du filtre égale à la taille du pixel dans le plan XY. Pour effectuer un traçage semi-automatique des dendrites, à partir du module de traçage de filament dans l’onglet Tranche, utilisez l’outil Distance pour estimer le diamètre de la dendrite.

Ensuite, dans l’onglet Surpass, cliquez sur l’outil Filaments et choisissez Skip Automatic Creation pour une meilleure robustesse. Dans l’onglet Dessiner qui s’affiche, sélectionnez AutoPath comme méthode, Dendrite comme type, et entrez le diamètre estimé de la dendrite. À l’aide du mode de sélection du pointeur, transformez le curseur en boîte, puis choisissez Maj et cliquez avec le bouton droit de la souris sur le point de départ de la dendrite. Le logiciel effectuera les premiers calculs.

Maintenant, déplacez le pointeur le long de la dendrite. À partir du point de départ, une ligne jaune représentant le chemin de dendrite le plus probable est affichée. Appuyez sur Maj et cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’extrémité de la dendrite. Pour effectuer la segmentation automatisée du dos, dans l’interface du module, cliquez sur l’onglet Création. Dans la liste déroulante Rebuild, choisissez Rebuild Dendrite Diameter (Reconstruire le diamètre de la dendrite) et cochez la case Conserver les données. Cliquez ensuite sur Reconstruire.

Définissez le seuil de sorte que le volume segmenté corresponde au volume réel de dendrites. En tant qu’algorithme, sélectionnez la distance la plus courte de la carte de distance. Cliquez ensuite sur le bouton Suivant. Sous l’onglet Tranche, déterminez le plus petit diamètre de tête de colonne vertébrale et la longueur maximale.

Ensuite, sous l’onglet Surpass, entrez les paramètres. Des valeurs autour de 200 à 300 nanomètres pour un diamètre minimal et de 4 micromètres pour une longueur maximale sont de bons points de départ. Sans cocher la case Autoriser les épines, cliquez sur le bouton Suivant.

Ensuite, ajustez le seuil des points de départ afin que les points bleus représentant les épines se localisent sur les têtes de colonne vertébrale réelles. Cliquez ensuite sur Suivant. Le calcul de base sera maintenant effectué et peut prendre du temps. Pour classer les épines, sous l’onglet Outils de l’interface du module, cliquez sur Classifier les épines.

Après avoir vérifié qu’il y a quatre classes comme indiqué dans le protocole texte, l’interface du module générera quatre nouveaux objets filament avec les résultats de la classification. Enfin, exportez les données statistiques, sous l’onglet Statistiques en cliquant sur Exporter toutes les statistiques dans un fichier.