Name: Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Découvrez la photolyse de composés en cage pour étudier la transduction olfactive chez les neurones sensoriels de souris. Cette méthode par patch-clamp permet d'activer et de mesurer précisément les canaux ioniques impliqués dans le signal olfactif.

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
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<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Photolyse de composés en cage combiné avec des enregistrements de patch-clamp est une technique utile pour obtenir des sauts rapides et locales de la concentration de molécules actives physiologiquement à l&#39;intérieur et l&#39;extérieur des cellules. Plusieurs types de composés1 cage ont été synthétisés, et cette technique peut être appliquée à divers types de cellules, y compris les cellules en culture exprimant les canaux ioniques qui peuvent être activées ou modulée par photolyse de certains des composés disponibl...

<table border="1"><tbody><tr><th> Équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Adapter Module lampe flash au microscope </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> Air de table </td><td> TMC </td><td> Micro-g 63-534 </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;acquisition de données </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp 8 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;analyse de données </td><td> WaveMetrics </td><td> Igor </td><td></td></tr><tr><td> Miroir pour module adaptateur </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-électrode </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Faraday cage </td><td> Custom made </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cube de filtre </td><td> Olympus </td><td> U-UTH </td><td> Filtre d&#39;excitation enlevés </td></tr><tr><td> Lampe flash </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> JML-C2 </td><td></td></tr><tr><td> Pince Dumont # 55 </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td> Capillaires en verre </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> PG10165-4 </td><td></td></tr><tr><td> Plat à fond de verre </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> FD35-100 </td><td></td></tr><tr><td> Illuminateur </td><td> Olympus </td><td> Highlight 3100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulateurs </td><td> Luigs &amp; Neumann </td><td> SM I </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette Puller </td><td> Narishige </td><td> PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur </td><td> HesaVision </td><td> MTB-01 </td><td></td></tr><tr><td> Les filtres neutres </td><td> Omega Optical </td><td> varie </td><td></td></tr><tr><td> Objectif 100X </td><td> Zeiss </td><td> Fluar 440285 </td><td> Soit Zeiss ou Olympus </td></tr><tr><td> Objectif 100X </td><td> Olympus </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> Soit Zeiss ou Olympus </td></tr><tr><td> Optique UV shortpass filtre </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur de patch-clamp </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> Assemblée diode photo </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td> Quartz guide de lumière </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> varie </td><td> Nous utilisons 600 um de diamètre </td></tr><tr><td> Fil d&#39;Argent </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> Argent-chaussée granulés </td><td> Warner instruments </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> Xénon lampe à arc </td><td> Rapp optoélectroniques </td><td> XBL JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th> Réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> BCMCM-cage AMPc </td><td> BioLog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> Albumine sérique bovine (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 0,1 M solution standard </td><td> Fluka </td><td> 21059 </td></tr><tr><td> Caged Ca: DMNP-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> Cystéine </td><td> Sigma </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavaline A de type V (ConA) </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> Sigma </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63020 </td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> Sigma </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

La photolyse de composés en cage permet la production d&#39;une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs 1. Caged composés sont des molécules composées physiologiquement inactive par une cage chimique qui peut être rompu par un éclair de lumière ultraviolette. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de composés en cage pour l&#39;étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs. Le processus de transduction olfactive (Figure 1) se déroule dans les cils olfactifs des neurones sensoriels, où se liant aux récepteurs odorants conduit à l&#39;augmentation de l&#39;AMPc qui ouvre des nucléotides cycliques-dépendants (CNG) des canaux 2. D&#39;entrée de Ca par les canaux CNG active les canaux Cl Ca-activé. Nous montrons comment dissocier les neurones de l&#39;épithélium olfactif de souris 3 et comment activer les canaux CNG ou Ca-Cl activé les canaux par photolyse de l&#39;AMPc en cage en cage 4 ou 5 Ca &lt;/ Sup&gt;. Nous utilisons une lampe flash 6,7 à appliquer clignote ultraviolets pour la région ciliaire à uncage AMPc ou Ca alors de patch-clamp enregistrements sont prises pour mesurer le courant dans la cellule entière voltage-clamp de configuration 8-11.

La photolyse de composés en cage permet la production d&#39;une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de l&#39;AMPc en cage ou en cage Ca pour l&#39;étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

La photolyse de composés cagés permet de produire des augmentations rapides et localisées de la concentration de divers composés physiologiquement actifs1. ...

Notre sens de l'odorat nous permet de détecter et de reconnaître des produits chimiques volatils présents dans l'environnement extérieur. Les odeurs se lient à des récepteurs situés dans la muqueuse des neurones sensoriels olfactifs et activent une cascade de transduction qui conduit à l'ouverture de canaux activés par les nucléotides cycliques, suivie par des canaux chlorure activés par le calcium. L'objectif général de cette procédure est de montrer comment activer directement ces canaux à l'aide d'une impulsion lumineuse sur des composés piégés, lesquels sont des molécules rendues physiologiquement inactives par un groupement chimique protecteur.Un flash de lumière ultraviolette brise une cage et libère le composé physiologiquement actif piégé. Des cyclones, mp ou du calcium piégé sont inclus dans la solution intracellulaire, remplissant une micropipette en configuration de patch, puis diffusent vers le compartiment des neurones sensoriels olfactifs. Un flash ultraviolet est appliqué à la région caryoplasmeuse afin d'activer un cyclone, un mp ou le calcium, pendant que des enregistrements en patch-clamp sont effectués pour mesurer le courant dans une configuration de clampage de voltage en tout-ou-rien.Bonjour. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'enregistrement en configuration patch clamp combinée à des impulsions FE de composés piégés. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les canaux activés par le CMP et les canaux à la choline activés par le calcium dans les neurones sensoriels olfactifs. Commençons donc.Le système d'enregistrement par électrode à micro-plot utilisé ici comprend un microscope inversé, un système de perfusion, un micromanipulateur, une électrode d'enregistrement et une électrode de référence reliée à l'étage d'entrée de l'amplificateur d'électrode à micro-plot, le tout monté sur une table anti-vibrations à l'intérieur d'une cage de Faraday. L'amplificateur d'électrode à micro-plot est connecté à un convertisseur analogique-numérique sur l'ordinateur, muni d'un logiciel pour l'acquisition des données. Pour produire un flash de lumière ultraviolette de haute intensité, nous utilisons une lampe flash Excelon.L'impulsion lumineuse peut être déclenchée manuellement ou par ordinateur à l'aide du même logiciel qui contrôle l'acquisition électrophysiologique. Les meilleures longueurs d'onde pour les expériences photo sont sélectionnées en insérant un filtre UV dans un emplacement de sortie de la lampe à éclats. L'intensité de l'impulsion lumineuse peut être modifiée en ajustant la tension ou la capacité de la lampe à éclats.Un contrôle plus précis de l'intensité lumineuse est obtenu en plaçant des filtres neutres dans un deuxième emplacement de sortie de la lampe à chair. L'impulsion lumineuse est dirigée vers le neurone cultivé dans des boîtes à fond en verre à l'aide d'un guide de lumière en fibre de quartz. Le guide de lumière est connecté à l'accessoire d'épi-fluorescence du microscope inversé.À l'aide d'un adaptateur, un cube de filtres modifié dépourvu de filtre d'excitation dirige une lumière UV vers le neurone par le biais d'un miroir dichroïque. La lumière est focalisée à travers un objectif à immersion huile de 100 x. La zone couverte par le tissu est visualisée en insérant la fibre optique dans un éclairage.L'image est visualisée sur un moniteur à l'aide d'une caméra CCD reliée au microscope. Le contrôle de la zone est dessiné sur le moniteur afin de localiser la zone exposée aux UV pour les expériences avant la dissection, préparez trois boîtes à fond en verre recouvertes de conna a et de poly. Pour préparer la dissection, remplissez deux boîtes de Petri de 50 millimètres recouvertes de sucre avec une solution de Ringer.Placez-les sur de la glace. Refroidissez également. Ajoutez de force 0,5 millilitre de la solution d'arrêt et la seringue contenant environ 10 millilitres de solution de Ringer.Commencez par la souris sacrifiée. Retirez la peau recouvrant le crâne, incisez le long des lignes de la mâchoire et placez la tête dans une boîte de Pétri revêtue d'argent. Placez la boîte sous un microscope stéréo à l'aide d'un scalpel selon le plan sagittal bi.Disséquez la tête selon la ligne médiane. Placez la moitié de la tête avec le côté médial vers le haut. Retirez soigneusement le septum pour exposer les terminaisons.Ici, nous présentons une image agrandie tout en retirant le septum à l’aide de la pince numéro trois dans le scalpel. Retirez soigneusement les extrémités bordées par votre épithélium adipeux. Transférez dans une autre boîte de Pétri revêtue d’argent à l’aide de la pince super fine numéro 55 et du scalpel.Séparez les morceaux d'épithélium olfactif du tissu sous-jacent. Transférez les morceaux d'épithélium olfactif dans un tube contenant un millilitre de solution Ringer sans cations divalents. Ajoutez ensuite la papaïne.L'utilisation de ciseaux microchirurgicaux signifie que l'incubation de l'épithélium s'effectue à température ambiante pendant trois minutes ; remélanger délicatement à nouveau avec les ciseaux microchirurgicaux. Attendre cinq minutes supplémentaires, puis à l'aide d'une pipette Pasteur à embout large, poli à la flamme, transférer dans un tube contenant la solution d'arrêt, centrifuger pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Ajouter environ un millilitre de solution de Ringer filtrée, puis mélanger délicatement à l'aide d'une pipette Pasteur polie à la flamme, dont l'embout présente un diamètre d'environ un millilitre.Placer la solution contenant les cellules au centre de trois boîtes en verre. Laisser les cellules se déposer pendant environ une heure à quatre degrés Celsius dans des boîtes à fond plat. Ensuite, ajouter la solution de Ringer.Travailler à la lumière tamisée afin d'éviter la dégradation des composés cagés par la lumière ambiante. Appliquer une goutte d'huile à immersion sur l'objectif 100 x. Placer une boîte de culture avec fond en verre contenant les neurones sensoriels olfactifs dissociés sur la platine du microscope inversé perfu.Avec solution de Ringer. Protéger la seringue contenant la solution intracellulaire avec des composés en cage de la lumière à l’aide de papier d’aluminium et la maintenir réfrigérée. Rechercher un neurone sensoriel olfactif isolé possédant un cil intact.Déplacez la platine du microscope afin de positionner la région Cary à l'intérieur de la zone dessinée sur l'écran. Pour localiser la zone d'illumination UV, remplissez une pipette de scellage avec une solution intracellulaire contenant le composé piégé. Insérez la pipette dans le support de la platine porte-électrode de l'amplificateur à clampage Apache.En utilisant des techniques standard de patch clamp. Approchez le soma du neurone avec une pipette de patch et obtenez un scellement gigaseal. Puis passez en mode cellule entière sur l'ordinateur.Démarrez un protocole de stimulation et enregistrez la réponse. Un protocole de stimulation typique fixe la tension à une valeur constante et déclenche l'émission d'un flash UV pour la lyse du composé piégé. Nous allons maintenant vous montrer quelques enregistrements représentatifs ; ci-dessous figure la réponse d'un neurone sensoriel isolé de ganglion rachidien de souris à la lyse du cycl mp piégé.La flèche en haut indique le moment du déclenchement d'un flash UV. Le courant activé par le Cycl MP a été enregistré à moins 60 millivolt dans une solution de Ringer extracellulaire pauvre en calcium. La phase croissante du courant était rapide et a été ajustée par une fonction exponentielle simple.Ici, nous observons un enregistrement du même neurone baigné dans une solution de Ringer normale, contenant un millimolaire de calcium. La phase ascendante du courant à moins 60 millivolt s'est considérablement réduite et est devenue multiphasique. Cela est dû à l'action du calcium pénétrant par les canaux activés par le récepteur C recyclant P, et activant un courant secondaire de chlorure.Dans cet exemple, nous avons fixé la tension à plus 60 millivolts. C'est une autre manière de réduire l'influx de calcium. La phase ascendante de la réponse due au piégeage du cyclone PN à plus 60 millivolts a été correctement décrite par une exponentielle simple, indiquant la présence d'une seule composante de courant.Un exemple de réponses obtenues par libération photo-induite de calcium à l'intérieur du cil est montré ; ce courant est porté par des ions chlorure. La tension était de moins 50 millivolt. Des réponses d'amplitudes croissantes ont été induites par la libération photochimique de calcium piégé à l'aide d'impulsions UV d'intensités croissantes.Nous venons de vous montrer comment enregistrer à partir de neurones sensoriels de ganglions rachidiens dissociés lors de cette procédure. Il est important de garder à l'esprit qu'une grande patience est nécessaire. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec l'expérience.

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Découvrez la photolyse de composés en cage pour étudier la transduction olfactive chez les neurones sensoriels de souris. Cette méthode par patch-clamp permet d'activer et de mesurer précisément les canaux ioniques impliqués dans le signal olfactif.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

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