Autologue de cellules progénitrices endothéliales-ensemencement de la technologie et les tests de biocompatibilité pour les appareils de cardio-vasculaires dans le modèle des grands animaux

L'objectif général de cette expérience est d'ensemencer des implants vasculaires avec des cellules progénitrices endothéliales dérivées du sang autologue, puis d'observer l'effet de ce traitement sur la thrombose dans un modèle animal de grande taille. Cela est réalisé en prélevant un échantillon de sang périphérique chez le porc pour isoler des cellules progénitrices endothéliales porcines à croissance tardive. Ensuite, un dispositif implantable.

Le tube en titane de notre étude de principe est fixé avec les PC autologues. Le dispositif est ensuite implanté dans la veine cave inférieure du porc. Les résultats montrent une protection contre la thrombose, fondée sur la perméabilité du tube en titane recouvert d'EPC, par opposition au tube métallique nu témoin, qui est obstrué.

La chirurgie de Duke s'engage à promouvoir une recherche novatrice et révolutionnaire. La présentation suivante illustre un exemple de notre travail transversal entre départements et disciplines afin de faire progresser la médecine. Le Dr. EK dirige un effort de recherche visant à développer une technologie de semis cellulaire qui préviendrait la thrombose en tapissant la surface en contact avec le sang des dispositifs vasculaires par les cellules progénitrices du patient lui-même.

Étant donné que ces cellules proviennent des mêmes patients qui recevront l'implant, nous évitons le rejet par le système immunitaire. Nos réussites et les méthodes décrites ici sont le fruit d'un effort collectif important. L'implantation chirurgicale sera démontrée par Sean Gage, du service de chirurgie vasculaire, Whitney Lane, étudiante en médecine à Duke, et moi-même.

Je voudrais maintenant vous présenter Alexander Janssen, étudiant au doctorat au Département de génie biomédical, qui va nous expliquer en détail le processus de semis cellulaire. Je vais démontrer comment ensemencer des tubes en titane avec des cellules progénitrices endothéliales dérivées du sang juste avant leur implantation dans un modèle porcin. Cette méthode constitue une preuve de concept, et les mêmes principes de base peuvent être appliqués à de nombreux autres dispositifs implantables, tels que les stents en nitinol et les dispositifs d'assistance circulatoire mécaniques. Les CPE sont isolées en cultivant la fraction de cellules mononucléées du sang porcin et apparaissent généralement après environ sept jours.

On peut les reconnaître à leur morphologie caractéristique en pavé. Étendre les EPC jusqu'à un nombre total de 9 millions de cellules en culture. Rincer les EPC préparées deux fois dans un milieu sans sérum, en prenant soin de limiter leur exposition à la lumière pendant et après le marquage.

Ensuite, recouvrez les cellules d'un marqueur fluorescent, le PKH 26, et notez le volume de solution appliqué. Incubez les cellules à température ambiante pendant quatre minutes. Arrêtez la réaction de marquage en ajoutant un volume équivalent de sérum porcin à la solution de colorant une minute plus tard.

Effectuez une dilution au demi des solutions combinées avec le milieu de croissance complet. Ensuite, aspirez le liquide et rincez les cellules trois fois avec le milieu de croissance complet, puis effectuez deux lavages avec du DPBS sans chlorure de calcium ni de magnésium. Puis, recouvrez les cellules de trypsine en notant bien le volume utilisé, et incubez-les à 37 degrés Celsius.

Après trois minutes d'incubation, utiliser la microscopie pour vérifier que les cellules se sont détachées, et dans l'affirmative, ajouter une quantité double de solution de neutralisation de la trypsine par rapport à celle qui a été ajoutée. Trypsin, combiner les solutions cellulaires dans un seul tube et mesurer la densité cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre. Enfin, former un culot de la suspension cellulaire et resuspendre les cellules dans au moins 4,5 millilitres de milieu sans sérum.

Après avoir préparé le porc pour la chirurgie, pratiquer une incision médiane à l’aide d’un bistouri n°15 depuis la deuxième paire de glandes mammaires jusqu’à la deuxième paire avant la dernière, en utilisant l’électrocoagulation. Poursuivre la dissection jusqu’au fascia abdominal.

Soulevez le péritoine avec des pinces à moustiques et pénétrez-y délicatement à l’aide de ciseaux Metzenbaum, extériorisez la vessie urinaire et placez une suture en surjet de Vicryl 3-0 dans la paroi vésicale. Pratiquez une incision ponction au centre et insérez un cathéter Foley de 16 French dans l’incision. Ensuite, administrez des fluides intraveineux afin de titrer la diurèse à au moins un millilitre par kilogramme par heure pendant l’intervention chirurgicale.

Ensuite, extériorisez l'intestin grêle légèrement dilaté et placez deux rétracteurs chirurgicaux Bour pour exposer la face postérieure de la cavité péritonéale, puis identifiez la veine cave inférieure (IVC) à l’aide d’une dissection fine et émoussée. Libérez soigneusement l’IVC des tissus environnants. Puis désinsérez complètement le vaisseau, depuis l’artère rénale droite en proximal jusqu’à la bifurcation de l’IVC en distal.

Une extrême prudence est requise lors de la dissection de la veine cave inférieure, car même un très petit défaut dans la veine cave inférieure peut entraîner une hémorragie rapide et l'exsanguination de l'animal. Toutes les branches latérales du segment de la veine cave inférieure nécessitent une attention particulière lors de la dissection et de la ligature des deux grosses veines lombaires postérieures situées immédiatement en amont de la bifurcation de la veine cave inférieure. Il existe souvent une grosse veine lombaire sur la face postérieure.

Dissez cette veine en la libérant et contrôlez-la à l’aide de brides vasculaires. Parallèlement à l’intervention chirurgicale, commencez à ensemencer l’implant avec des CEP avant de débuter cette procédure. Les supports de type chambre tissulaire en tube de titane doivent être entièrement assemblés et prêts à être utilisés dans un champ stérile.

Ouvrez l'ensemble en tube de titane stérilisé par gaz dans une seringue de 5 cm³. Retirez ensuite le piston de la seringue de 5 cm³, mais ne le jetez pas. Fixez un bouchon d'adaptation à la seringue. Utilisez une pipette pour remplir la seringue avec la suspension de CEP.

Ensuite, remettez le piston en place. Retirez le capuchon et insérez l'extrémité de la seringue contenant l'appât dans le tube en silicone ouvert de l'assemblage jusqu'à ce qu'il soit bien ajusté, sans aller plus loin. Éliminez toutes les bulles en faisant avancer lentement la solution cellulaire jusqu'à ce qu'elle atteigne le haut de la pièce buccale.

Ensuite, fermer l'assemblage avec un capuchon appât et le sceller avec du ruban adhésif dans un gant stérile. Insérer cet assemblage complet dans un support de seringue usiné et le placer dans une étuve à 37 degrés Celsius. Utiliser un niveau pour s'assurer que les chambres d'insertion sont bien horizontales et laisser l'assemblage incuber avec une rotation douce.

Poursuivre la chirurgie juste après la ligature de la VCI en administrant 100 unités d'héparine par kilogramme de porc. Ensuite, pincer immédiatement la VCI à un angle de 45 degrés en aval sur la VCI et la veine lombaire, puis en amont. Utiliser ensuite une lame de bistouri n°11 et des ciseaux à pot pour pratiquer une veineotomie longitudinale de quatre centimètres entre les pinces proximale et distale.

Évacuez tout sang de la VCI et rincez sa lumière interne avec du DPBS stérile. Insérez maintenant l'implant avec EPC ou un implant témoin en métal nu dans la VCI afin d'éviter le dessèchement des cellules et d'éliminer l'air. Remplissez la VCI avec du DPBS contenant du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.

Ensuite, fermer l’otomie veineuse à l’aide d’un point continu en proline 4-0 et retirer un clamp proximal pour débarrasser la VCI de l’air par un léger saignement rétrograde. Après l’hémorragie, retirer le clamp distal afin de maintenir l’implant en place. Appliquer un point de fixation sur le tube en PVC traversant la paroi veineuse.

Fermer l’aponévrose avec du OPDS sur une aiguille CT. Fermer l’espace sous-cutané avec deux points continus en Vicryl 2-0. Puis fermer la peau avec des agrafes.

Administrer jusqu'à 20 millilitres de Marcaine à 0,25 % par voie sous-cutanée le long du site d'incision et recouvrir la plaie de gaze et de Tegaderm pour soulager la douleur. Administrer de la flu Nixon et de l'oxymorphone par voie sous-cutanée selon les besoins. Interrompre l'anesthésie et, lorsque le porc se réveille, le ramener à sa cage au cours des sept jours suivants.

Administrer de l'atri toutes les 24 heures en tant que prophylaxie antibiotique et veiller à ce que le patch de fentanyl appliqué avant la chirurgie reste bien adhéré pendant trois jours au total. Après trois jours, les implants tubulaires en titane fixés ont été retirés et leurs surfaces internes ont été examinées. Sous une longueur d'onde d'excitation de 550 nanomètres, une couche confluente de cellules marquées de manière fluorescente a été observée dans un autre tube.

Les cellules des coupes ont été en outre colorées avec un marqueur d'adhésion cellulaire plaquettaire endothéliale afin de visualiser les limites cellulaires. Une grande variété de colorations peut être utilisée dans cette procédure. En revanche, un implant en tube de titane nu s'occlue complètement dans l'environnement prothrombotique à faible cisaillement de la veine cave inférieure.

Comme illustré sur les images A et C, le tube en titane fixé sur la cellule est montré sur l'image B et est resté exempt de caillot après notre procédure d'isolement avec du sang au pic. Les EPC apparaissent après une moyenne de sept jours en culture. Lors de la réalisation de la procédure chirurgicale, il est très important de disséquer soigneusement et délicatement la veine cave inférieure, car même la plus petite déchirure de la veine cave inférieure ou de ses branches latérales peut entraîner une exsanguination du porc. Après cette procédure, d'autres matériaux en contact avec le sang peuvent être rapidement endothélialisés afin de prévenir la thrombose.

Les stents vasculaires endothéliaux, par exemple, recouverts de nos CEP, imitent le revêtement naturel de la paroi des vaisseaux sanguins et pourraient prévenir la resténose et la thrombose du stent après son implantation. Notre technologie Quick See permettra de revêtir les dispositifs intravasculaires avec les cellules progénitrices endothéliales dérivées du sang du patient lui-même en quelques minutes, directement en salle d'opération ou en laboratoire de cathétérisation. Ainsi, aucune culture prolongée ex vivo n'est nécessaire.

Le temps sur l'appareil lui-même est évité et la technologie devient pratique pour une traduction dans la pratique clinique.