Name: Lectine à base disolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez l'isolement de motoneurones embryonnaires de souris par purification à base de lectine. Cette méthode permet d'obtenir des cultures enrichies pour étudier les mécanismes de survie neuronale.

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Nous tenons à remercier Sandra Bargen pour le soutien technique excellente. Ce travail a été soutenu par le département de recherche sur les protéines (PRD, TP A1.2 (RC et TS), et la recherche RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Les anticorps monoclonaux et les 39.4D5 F55A10 ont été obtenus à partir de l&#39;hybridome études développementales Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Pour les réactifs spéciaux: voir Tab. 1. Tous les autres réactifs sont mentionnés dans la qualité de grade culture cellulaire obtenue chez Sigma Aldrich. 1. Revêtement PORN-H/laminin des plats / lamelles <ol><li> Préparer la solution de travail de 0,5 mg / ml de poly-DL-ornithine bromhydrate (PORN-H) dans 150 mM de tampon borate de pH 8,35. <ol><li> Une solution stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampon borate peut être préparé à l'avance et stocké à -20 ° C. </li></ol></li><li> Stériliser lamelles de verre à la flamme dans l'éthanol 100% et laissez-les sécher à l'air. </li><li> Couvrir la surface avec suffisamment de porn-H solution de nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain laver trois fois avec de l'eau stérilisée et sécher à l'air des lamelles. </li><li> Préparer la solution de travail de 2,5 pg / ml de laminine dans HBSS <ol><li> Aliquotes peuvent être stockés à -20 ° C. Décongeler à 4 ° C immédiatement avant l'utilisation. </li></ol></li><li> Couvrir la surface du couvre-PORNO-H-revêtu de la solution la laminine et les laisser incuber pendant au moins 2 h à température ambiante jusqu'à utilisation. </li></ol> 2. Revêtement de lectine de la plaque d'épuration <ol><li> Préparer une solution de Tris 10 mM dans de l'eau stérilisée, pH 9,5. </li><li> Ajouter lectine (résoudre la lectine (Sigma L9640) de poudre dans HBSS) à une concentration finale de 10 pg / ml. </li><li> Enduire la surface d'un plat de 10 cm de culture cellulaire avec 8 ml de la solution de lectine et laisser incuber pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Laver la plaque trois fois avec HBSS et stocker dans HBSS jusqu'à utilisation. </li><li> Préparer un 30 mM KCl, 0,8% (p / v) de NaCl dépolarisation-solution. Stériliser par filtration et stocker à température ambiante (RT). </li></ol> 3. Milieu de culture des motoneurones <ol><li> Cheval de dégeler le sérum nuit à 4 ° C et inactiver à 55 ° C pendant 30 min, Aliquoter en 5 ml et conserver à -20 ° C. Aliquote de dégel directement avant de l'utiliser à température ambiante. </li><li> Boutique B27-supplément dans une aliqouts ml à -20 ° C. Dégel B27 complément à la température ambiante immédiatement avant utilisation. Éviter les cycles de gel et de dégel. </li><li> Glutamax Aliquoter en aliquots de 0,5 ml et conserver à -20 ° C et l'utiliser à 1:100. </li><li> Préparer une solution stock de 10 ug / ml dans le CNTF eau stérilisée avec la BSA à 0,1%. Conserver à -20 ° C. </li><li> Mélangez 46 ml de milieu neurobasal avec 2,5 ml de sérum de chevaux, 1 ml B27-complément et 0,5 ml glutamax directement avant l'utilisation. </li><li> Ajouter CNTF à une concentration finale de 10 ng / ml de milieu et préchauffer à moyen et à 37 ° C. </li></ol> 4. Dissection de la moelle épinière <ol><li> Sacrifice d'une souris E12.5 enceintes et enlever les embryons soigneusement. Ajouter suffisamment RT HBSS pour couvrir complètement les embryons. </li><li> Retirez la tête et la queue et le lieu de la face arrière d'embryon avec des membres enfourché. </li><li> Fixer l'embryon avec une pince et retirer la peau externe avec la pince d'autres. </li><li> Retirer la moelle épinière en perçant la pince sous lui et il lève avec les mouvements de scie des deux côtés de la moelle épinière. </li><li> Transférer la moelle épinière isolée d'un nouveau plat avec HBSS et ouvrir le canal central de la moelle épinière sur la face dorsale. </li><li> Retirez les ganglions rachidiens en supprimant les méninges entourant la moelle épinière. </li><li> Ramassez les pièces lombaire de la moelle épinière de jusqu'à 6 embryons par plaque lectine dans un tube de réaction Eppendorf remplis avec HBSS 1 ml et stocker sur la glace jusqu'à ce que la préparation est faite. </li></ol> 5. Enrichissement des motoneurones par la lectine à base de purification Remarque: Avant de commencer les prochaines étapes, la dernière ici, préparer et préchauffer le support (voir l'étape 3.) <ol><li> Préparer une solution de trypsine par la résolution 1 g de trypsine dans du HBSS de 100 ml, conserver à -20 ° C et laisser décongeler à 4 ° C. </li><li> Mélanger 1g trypsine-inhibiteur avec 98 ml de HBSS et 2 ml d'une M pH 7,4 HEPES, aliquotes de 1 ml doivent être conservés à 4 ° C. </li><li> Transférer le tube avec la moelle épinière d'une hotte de culture cellulaire et retirez soigneusement 700 pl de la HBSS. </li><li> Ajouter 7,5 ul solution de trypsine et mélanger en inversant le tube soigneusement. </li><li> Effectuer trypsination pendant 8 min à 37 ° C. </li><li> Arrêter la réaction par addition de 30 ul inhibiteur de la trypsine et la pipette de haut en bas (triturer) attentivement 10-15 fois avec une pointe de pipette 1000 ul jusqu'au agrégats cellulaires sont plus visibles. Répétez la trituration avec une pipette de 20 à 200 ul et la pointe correspondante. </li><li> Pipeter la solution de cellules dans la plaque HBSS rempli de lectine et de disperser les cellules en faisant tourner la plaque. </li><li> Conservez la plaque lectine pendant 60 min à température ambiante sur une surface exempte de vibrations. Couvrir pour éviter toute contamination. </li><li> Retirez le HBSS très doucement et laver soigneusement la plaque 4 fois avec préchauffé HBSS pour éliminer les fragments de cellules et les cellules non attachées / seules. </li><li> Immédiatement après la dernière étape de lavage, ajouter 500 ul solution de dépolarisation de la plaque et laisser incuber pendant 1min. </li><li> Faciliter le détachement des cellules lectine liée par des tremblements etfrappant la plaque. </li><li> Remplir la plaque avec 2 ml milieu de culture pré-chauffé et le transfert d'un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Comptez le nombre de cellules avec une chambre de comptage Neubauer. </li><li> Assiette de la cellule sur les lamelles de la laminine enduits ou plaques dans un nombre approprié selon l'application. </li><li> Effectuer un échange de support le jour 1 et ensuite tous les deux jours par remplacement minutieuse de 50% de l'ancien milieu. Toujours utiliser des pré-chauffée, un milieu fraîchement préparé une nouvelle culture. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Motoneurones embryonnaires peuvent être obtenues à partir d'embryons de souris à E12 à E14. 2-3% de la population totale des cellules de la moelle épinière lombaire se compose des motoneurones et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont p75 NTR-positifs ainsi, il est important de se débarrasser de ces cellules avant de commencer la procédure preplating lectine base ( Pour un aperçu voir Figure 1 et Figure 2). Deuxièmement, les méninges notamment des cellules fortement divisant qui devraient être exclus aussi, comme ils ne peuvent pas être correctement supprimés par la procédure preplating lectine base (Figure 2 et Figure 3). Dans le pire des cas, ces cellules peuvent proliférer les plaques de culture. Les images représentant la figure 3B et 3D aussi donner une impression sur la plus faible densité cellulaire après le lavage des procédures ont été effectuées (voir l'étape 5.9 du protocole). Les cultures de motoneurones embryonnaires de souris sont généralement maintenues jusqu'à cinq ou sept jours. Durant cette période, les cellules établissent leurs neurites jusqu'à une longueur maximale (figure 4). Longueurs neurites dépendent fortement du substrat sur ​​les 8 assiettes. Le substrat typique est la laminine qui est couché sur porn-H boîtes de culture couverte. Motoneurones peuvent également se développer sur d'autres substrats ou moins définis, comme les matrices extracellulaires générés par 8 lyse de l'eau. En cas de revêtement, la longueur des neurites et la zone sous-optimale du cône de croissance sont réduites et la mort cellulaire augmente habituellement. Support trophique joue un rôle crucial pour la survie des motoneurones embryonnaires de souris en culture. La survie des cellules initialement plaqué sur sept jours chuter à 10% à 20% sans appui 6 trophiques. Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) sont les facteurs les plus couramment utilisés mais d'autres peuvent favoriser la survie aussi bien [facteur inhibiteur de leucémie (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Schéma de la figure 1. Pour la préparation des motoneurones embryonnaires de souris. Le schéma illustre les différentes étapes pour l'isolement et la culture des motoneurones embryonnaires de souris. Abréviations: SC: la moelle épinière; HBSS: solution saline équilibrée de Hanks, MN: motoneurone. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Isolement de la partie lombaire de la moelle épinière de souris E12.5 A:.. E12.5 embryon de souris. Pour l'étape suivante, la tête et la queue sont supprimés et le corps est placé dans une position dorsale B-up: l'embryon dans une position dorsale-up. Pince à gauche et à droite de la moelle épinière sont la fixation du corps de l'embryon dans sa position. Un des forceps est ensuite utilisé pour couper la peau et à réduire au-dessous de la moelle épinière que l'autre est utilisée pour fixer l'embryon dans sa position C:. Isolé de la moelle épinière à partir d'embryons de souris E12.5. Les parties de la moelle épinière (cervicale, thoracique, lombaire) sont indiqués. La moelle épinière est entourée par les méninges et une partie du ganglion de la racine dorsale encore y attacher D:. La moelle épinière est coupé longitudinalement sur ​​la face dorsale de l'ouvrir vers le canal central E:. Les méninges sur la face ventrale sont maintenant prises hors de la moelle épinière aplati. Note: Bien pris son envol, la partie lombaire est marquée par une petite coupure F:. Seule la partie lombaire de la moelle épinière est alors pris pour d'autres procédures. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: Détermination et l'isolement des îlots de cellules positives de la moelle épinière lombaire des embryons de souris E12.5 A:.. Les étiquettes Islet-1 / 2 d'anticorps colonnes motoneurone dans la moelle épinière lombaire embryonnaire (rouge, flèche) et des étiquettes Hoechst tous les noyaux au sein de la section. Coupe transversale d'un cordon Lumar E12.5 épinière. E12.5 embryons de souris ont été fixés dans l'immersion-paraformaldéhyde à 4% pendant 6 h, lavée 3 fois avec du tampon phosphate salin et traitée avec du saccharose selon des procédures standard. Cryocoupes de 20 um ont été prises avec un cryostat et les sections ont été traitées pour la coloration immunohistochimique selon les procédures habituelles 11. Les sections Ware suite étiqueté avec Hoechst pour la localisation des noyaux cellulaires. Notez queles neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont Islet-1/2-positive ainsi et que la procédure de préparation des pièces exclut ce tissu de la procédure d'isolement B:. Islet-1 / 2 étiquetés (rouge, flèche) dissocié lombaires cellules de la moelle épinière du E12. 5 embryons, gauche - avant et à droite - après lectine basé preplating. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour visualiser tous les noyaux des cellules C:. Quantification des cellules Islet-1/2-positive avant et après la lectine à base preplating D:. Nkx6.1 motoneurones marqué à partir de E12.5 embryons après une journée dans la culture. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour cisualieze tous les noyaux. Notez que 90% de toutes les cellules sont Nkx6.1 positif. Abréviations: SC: la moelle épinière; MN: motoneurone; DRG: ganglion de la racine dorsale. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 Caractérisation des motoneurones de souris E12.5 A et B:.. Enrichi isolées de souris E12.5 motoneurones spinaux lombaires exprimer p75 NTR à 0 jours in vitro (0div) et le jour 2 in vitro (2div). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% et ensuite colorées pour p75 NTR conformément aux procédures standard. Les cellules ont été contre l'aide de Hoechst pour visualiser tous les noyaux C:. Motoneurones Enrichi après 5 jours in vitro (5div) sur porn-H et la laminine comme substrats de culture et en présence de vitraux pour la CNTF β-III-tubuline. Notez que les cellules se sont développées hors neurites longs et afficher la morphologie du motoneurone typique avec un plus long (ramifié) processus et un ou plusieurs processus plus courts (axones et dendrites). Abréviations: MN: motoneurone; div: jours in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Après la dissociation sans lectine basé preplating </td></tr><tr><td> Le nombre total de cellules / SC </td><td> Bleu Trypan de cellules positives [%] </td><td> Cellules positives Islet-1/2- [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Moyenne ± SD </td><td> 1.021.0 147,1 ± </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Avec lectine basé preplating </td></tr><tr><td> Nombre de cellules après preplating / SC </td><td> Bleu Trypan de cellules positives [%] </td><td> Cellules positives Islet-1/2- [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Moyenne ± SD </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Sommaire des résultats des procédures d'isolement représentant de motoneurones embryonnaires de souris du stade E12.5. À partir de 3 différentes procédures d'isolement spécialement à cet effet sont donnés comme le nombre total ou les numéros de pourcentage ± SD. Abréviation: LC: la moelle épinière; SD: déviation standard. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 cellules positives avec p75 panoramique [%] </td><td> Islet-1 / 2 cellules positives avec la lectine basée panoramique [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Résultats de comparaison de lectine à base et p75-1 à base de panoramiques nombre de cellules des motoneurones. Numéros sont donnés à titre pourcentage ± SD.

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
<li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li>
<li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;avantage de cette technique basée sur preplating lectine, c&#39;est qu&#39;il est moins cher que le p75 NTR procédure basée sur le panoramique, et la lectine est plus stable que les anticorps. L&#39;enrichissement énumérés dans la Fig. 2 et Tab. 1 montre que la procédure permet à la purification des nombres similaires de cellules et que la majorité de ces cellules expriment le marqueur motoneurone Islet-1 / 2. L&#39;étape la plus critique est la procédure d&#39;isolement de la moelle épinière lombaire. Suppression des méninges et de la DRG (Fig. 2) est indispensable pour la procédure de purification par la suite lectine basé preplating. Si cela a été géré correctement, presque toutes les cellules expriment la p75 NTR (pour l&#39;image représentant voir Fig. 3a). La raison de la différence entre l&#39;expression de l&#39;Islet-1 / 2 et p75 NTR est très probablement parce que motoneurones lombaires différentielle expriment des niveaux supérieurs et inférieurs de l&#39;Islet-1 / 2 10. En cas de faibles niveaux de l&#39;Islet-1 / 2 d&#39;expression que cela pourrait avoir échappé à notre attention dans la coloration et le comptage immuncytochemical ultérieures que nous avons été sévères à l&#39;égard de cellules positives contre un solde négatif (Tab. 1). De plus, le tableau 1 montre clairement que les cellules isolées survivent à la procédure dans un état sain, car il ya seulement quelques trypan bleu cellules positives qui indiquent que les cellules sont endommagées de façon irréversible. Cette procédure permet également l&#39;isolement altératives des motoneurones à partir d&#39;embryons unique et donc des portées génotype mixte de souris embryonnaires. En conclusion, cette alternative à la procédure panoramique avec l&#39;anticorps p75 NTR 6 a même s&#39;ils ne sont pas des capacités identiques en termes de domaines d&#39;application possibles et fournit une méthode de purification efficace et bon marché alternatif pour motoneurones embryonnaires de souris.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine bromhydrate </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Verre lamelles </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 ou 14mm </td></tr><tr><td> Lectine </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture cellulaire </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta de la surface </td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Chaque lot doit être testé pour la culture MN </td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td></td><td></td><td> Acier inoxydable, taille 4 ou 5 </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> La trypsine-inhibiteur </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Surnageant de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Surnageant de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Table des réactifs spécifiques et les équipements.

lectine à base d&#39;isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Motoneurones spinaux évoluer vers les stades postmitotiques travers le développement précoce du système nerveux embryonnaire, et ensuite pousser les dendrites et les axones. Cellules neuroépithéliales du tube neural qui expriment Nkx6.1 sont les cellules précurseurs des motoneurones spinaux uniques 1. Bien motoneurones postmitotiques déplacer vers leur position finale et s&#39;organiser en colonnes le long du tractus épinière 2,3. Plus de 90% de l&#39;ensemble de ces motoneurones différenciées et positionné exprimer les facteurs de transcription Islet 1 / 2. Ils innervent les muscles des membres ainsi que ceux du corps et les organes internes. Entre autres, les motoneurones généralement expriment les récepteurs de haute affinité pour le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et la neurotrophine-3 (NT-3), la tropomyosine liés kinase B et C (TrkB, TrkC). Ils n&#39;expriment pas la kinase tropomyosine liés A 4 (TrkA). Outre les deux récepteurs de haute affinité, les motoneurones expriment la faible affinité pour le récepteur neurotrophine p75 NTR. Le RNT p75 peut lier tous les neurotrophines avec une affinité similaire mais inférieur à toutes les neurotrophines que les récepteurs de haute affinité lierait les neurotrophines matures. Au sein de la moelle épinière embryonnaire, la RNT p75 est exclusivement exprimé par les motoneurones spinaux 5. Cela a été utilisé pour développer des techniques d&#39;isolement des motoneurones de purifier les cellules de la grande majorité des cellules environnantes 6. Motoneurones Isoler avec l&#39;aide d&#39;anticorps spécifiques (panning) contre les domaines extracellulaires de p75 NTR s&#39;est avéré être une méthode coûteuse que la quantité d&#39;anticorps utilisés pour une expérience unique est élevé en raison de la taille de la plaque utilisée pour le panoramique. Une alternative beaucoup plus économique est l&#39;utilisation de la lectine. Lectine a été démontré se lier spécifiquement à p75 NTR ainsi 7. La méthode suivante décrit une technique alternative utilisant agglutinine de germe de blé pour une procédure preplating au lieu de l&#39;anticorps p75 NTR. La lectine est une alternative très bon marché à l&#39;anticorps p75 NTR et les qualités de purification utilisant la lectine sont comparables à celle de l&#39;anticorps p75 NTR. Motoneurones de la moelle épinière embryonnaire peut être isolé par cette méthode, survivre et se développer hors des neurites.

Une autre façon d&#39;isoler les motoneurones embryonnaires de souris à partir de la moelle épinière est décrite. La méthode prend en compte le fait que la lectine peuvent se lier au nerf affinité p75NTR bas du récepteur du facteur de croissance. Cette lectine preplating basé permet une purification similaire à celle d&#39;un anticorps spécifique contre le p75NTR.

Lectine à base d&#39;isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

Les motoneurones spinaux évoluent vers des stades postmitotiques tout au long du développement précoce du système nerveux embryonnaire, puis développent des dendrites et des axones.

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une culture enrichie de neurones moteurs embryonnaires de souris. La procédure commence par l'euthanasie d'une souris gravide, l'extraction des embryons et la dissection de la moelle épinière lombaire. L'étape suivante consiste à dissocier la moelle épinière en une suspension monocellulaire par un traitement enzymatique et une durée déterminée.Ensuite, effectuez la purification par lectine afin de séparer les motoneurones des restes cellulaires. Puis, après avoir estimé le nombre total de cellules, celles-ci sont mises en culture dans des boîtes ou sur des lamelles précodées. La dernière étape consiste à ajuster la densité de la culture en fonction de la procédure expérimentale.En fin de compte, à mesure que les cellules en culture grandissent, une morphologie typique de neurones moteurs peut être observée pour le succès. Lors de la préparation de la culture de souris et de neurones moteurs, il est essentiel de tester différents matériaux, substances et solutions. Étant donné que les cellules peuvent réagir de manière sensible à toute modification de ceux-ci, les neurones moteurs peuvent être cultivés à haute densité afin d'isoler des ARN ou des protéines.Cependant, il est possible que les cellules forment des réseaux neuronaux actifs, conduisant à une survie indépendante d’un soutien par le trafic. Par conséquent, dans certains cas, il pourrait être préférable de cultiver les cellules à faible densité pour des analyses d’ARN ou de protéines, procédure que démontreront Rebecca Conrad et Terza Japan. Tous deux sont étudiants diplômés dans notre laboratoire.Commencez cette procédure en préparant la solution de travail contenant 0,5 milligramme par millilitre de poly DL-ornithine hydrobromure dans un tampon bide 150 millimolaire à pH 8,35, puis stérilisez la solution par filtration. Ensuite, stérilisez les lamelles en verre en les passant brièvement à la flamme après les avoir imbibées d'éthanol à 100 %. Laissez-les ensuite sécher à l'air ambiant et recouvrez la surface des lamelles d'une quantité suffisante de solution porn H, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, poursuivez l'expérience.Les laver trois fois avec de l'eau stérilisée. Puis les laisser sécher à l'air après cela. Préparer la solution de travail à 2,5 microgrammes par millilitre.La laminine dans le HBSS recouvre la surface des lamelles recouvertes de porn H avec la solution de laminine. Incuber ensuite pendant au moins deux heures à température ambiante jusqu'à utilisation. L'étape suivante consiste à préparer une solution de triss 10 millimolaire dans de l'eau stérilisée à pH 9,5.Après filtration de la solution, ajouter la lectine une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Ensuite, recouvrir la surface d'une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres avec huit millilitres de la solution de lectine et incuber pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Puis, laver la plaque avec du HBS S trois fois et conserver la plaque dans du HBSS jusqu'à utilisation.Après cela, préparez la solution de dépolarisation contenant 30 millimolaire de chlorure de potassium et 0,8 % de chlorure de sodium. Puis stérilisez le mélange par filtration et conservez-le à température ambiante. Pour commencer cette procédure, décongelez le sérum de cheval toute une nuit à quatre degrés Celsius.Ensuite, inactiver à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes, aliquoter en portions de cinq millilitres et conserver les aliquotes à moins 20 degrés Celsius. Décongeler une aliquote directement à température ambiante avant utilisation, puis conserver le complément B 27 en aliquotes d'un millilitre à moins 20 degrés Celsius.Décongeler à température ambiante juste avant utilisation. Éviter les cycles de congélation-décongélation ; aliquoter le glutamate en fractions de 0,5 millilitre et les conserver à moins 20 degrés Celsius. Préparer ensuite une solution mère de 10 microgrammes par millilitre de CNTF dans de l'eau stérilisée contenant 0,1 % de BSA, et la conserver à moins 20 degrés Celsius.Enfin, mélanger 46 millilitres de milieu neurobasal avec 2,5 millilitres de sérum de cheval, 1 millilitre de supplément B 27 et 0,5 millilitres de glutamate. Ajouter directement le CNTF pour obtenir une concentration finale dans le milieu de 10 nanogrammes par millilitre. Préchauffer à 37 degrés Celsius.À ce stade, sacrifier une souris gestante à 12,5 jours de développement embryonnaire et retirer soigneusement les embryons. Ajouter du HBSS à température ambiante pour recouvrir complètement les embryons, puis déplacer un embryon sous un microscope. Ensuite, retirer la tête et la queue, et placer l'embryon sur le dos avec les membres écartés.Ensuite, fixez l'embryon avec une paire de forceps et retirez la peau externe à l'aide de l'autre paire de forceps. Après cela, retirez la moelle épinière en perforant avec le forceps en dessous et en la soulevant avec des mouvements de scie de chaque côté de la moelle épinière. Transférez la moelle épinière isolée dans un nouveau plat contenant du HBSS.Ouvrez le canal central de la moelle épinière du côté dorsal. Ensuite, retirez les ganglions de la racine dorsale en éliminant les méninges entourant la moelle épinière. Puis transférez les moelles épinières dans un tube à réaction EOR contenant un millilitre de HBSS.Les maintenir sur de la glace jusqu'à ce que la préparation pour la digestion de la moelle épinière soit prête. Transférer le tube contenant les moelles épinières dans une hotte de culture cellulaire. Retirer soigneusement 700 microlitres de HBSS, puis ajouter 7,5 microlitres de solution de tripsine 1 % décongelée, préparée précédemment comme décrit dans le manuscrit accompagnant.Et mélangez en inversant délicatement le tube. Réalisez la trypsination pendant huit minutes à 37 degrés Celsius. Arrêtez ensuite la réaction en ajoutant 30 microlitres d'inhibiteur de trypsine, puis pipetez doucement de haut en bas 10 à 15 fois avec une pointe de pipette de 1000 microlitres jusqu’à ce qu’aucun agrégat cellulaire ne soit visible.Ensuite, répétez l’opération avec une pipette de 20 à 200 microlitres. Pipetez la solution cellulaire dans la plaque de lectine remplie de HBSS et dispersez les cellules en tournant doucement la plaque. Couvrez la plaque de lectine pour éviter toute contamination et maintenez-la sur une surface exempte de vibrations à température ambiante pendant 60 minutes.Retirer très délicatement le HBSS et laver la plaque soigneusement quatre fois avec du HBSS préchauffé afin d'éliminer les fragments cellulaires et les cellules non attachées. Immédiatement après la dernière étape de lavage, ajouter 500 microlitres de la solution de dépolarisation contenant 30 millimolaire de chlorure de potassium et 0,8 % de chlorure de sodium sur la plaque et incuber pendant une minute. Agiter et tapoter doucement la plaque pour faciliter le détachement des cellules liées à la lectine. Compléter ensuite la plaque avec deux millilitres de milieu de culture préchauffé. Puis transférer le contenu dans un tube conique de 15 millilitres.Comptez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage sans bower. Ensuite, plaquez les cellules sur des lamelles ou des plaques recouvertes de laminine. Changez le milieu au jour un, puis toutes les deux journées, en remplaçant soigneusement 50 % de l’ancien milieu par du milieu de culture frais préalablement réchauffé.Le milieu illustré ici est une coupe transversale d’un cordon spinal lombaire embryonnaire de 12,5 jours, marqué à l’aide de herst afin de localiser les noyaux cellulaires. La flèche indique les colonnes de motoneurones situées dans le cordon spinal lombaire embryonnaire, marquées par l’anticorps eyelet one two. Exemple de cellules dissociées marquées par eyelet one two.Les cellules de la moelle épinière lombaire provenant d'embryons de 12,5 jours avant et après le pré-plaquage basé sur les lectines sont présentées respectivement dans les panneaux gauche et droit. Les résultats quantitatifs des cellules positives pour l'œillet un deux avant et après le pré-plaquage basé sur les lectines sont indiqués ici. Voici un exemple illustrant l'enrichissement des motoneurones au jour zéro et au jour deux : les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4 %, puis colorées pour le P 75 NTR.Suivant les procédures standard, elles ont ensuite été contre-colorées à l'aide d'accroches afin de visualiser tous les noyaux après cinq jours in vitro sur porn H et lamellé comme substrats de culture et en présence de CNTF ; pour la coloration de la bêta trois tubuline, les cellules ont développé de longs neurites et affiché la morphologie typique des motoneurones, avec un processus plus long et un ou plusieurs processus plus courts. Les motoneurones jouent un rôle central dans le corps de tous les vertébrés et invertébrés.Cette isolation est extrêmement utile pour l'analyse des mécanismes de survie des motoneurones. Grâce à ces cellules isolées, vous pouvez analyser sélectivement les activités d'autres cellules interagissantes, des protéines, des glucides, et appliquer des substances pharmacologiques sur la survie et la croissance neuronale de ces cellules.

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