Lectine à base d'isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une culture enrichie d’embryons de motoneurones de souris. La procédure commence par le sacrifice d’une souris enceinte, l’ablation des embryons et la dissection de la moelle épinière lombaire. L’étape suivante consiste à dissocier la moelle épinière en une suspension unicellulaire par traitement enzymatique et durée.

Ensuite, effectuez la purification à base de lectine pour séparer les motoneurones des restes cellulaires. Ensuite, après avoir estimé le nombre total de cellules, les cellules sont plaquées sur des plats précodés ou des bordereaux de couverture. La dernière étape consiste à ajuster la densité de la culture en fonction de la procédure expérimentale.

En fin de compte, à mesure que les cellules cultivées se développent, la morphologie typique des motoneurones peut être observée pour le succès. Lors de la préparation de la culture de souris et de motoneurones, il est essentiel de tester différents matériaux, substances et solutions. Comme les cellules peuvent réagir de manière sensible à l’un de ces changements, les motoneurones peuvent être cultivés à haute densité pour l’isolement de l’ARN ou des protéines.

Cependant, il est possible que les cellules construisent des réseaux neuronaux actifs, ce qui conduit à la survie indépendamment du soutien du trafic. Par conséquent, dans certains cas, il pourrait être préférable de cultiver les cellules à faible densité pour l’analyse de l’ARN ou des protéines, démontrant cette procédure par Rebecca Conrad et Terza Japan. Tous deux sont étudiants aux cycles supérieurs dans notre laboratoire.

Commencez cette procédure en préparant la solution de travail de 0,5 milligramme par millilitre de bromhydrate d’ornithine poly DL dans un tampon de bide de 150 millimolaires avec un pH de 8,35 et stérilisez la solution par filtration. Ensuite, stérilisez les lamelles en verre en les flambant à 100 % d’éthanol. Ensuite, laissez-les sécher à l’air, couvrez la surface des couvertures avec une solution porno H suffisante pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Lavez-les trois fois avec de l’eau stérilisée. Ensuite, laissez-les sécher à l’air libre après cela. Préparez la solution de travail de 2,5 microgrammes par millilitre.

La laminine dans HBSS couvre la surface des lamelles revêtues de porno H avec la solution de laminine. Ensuite, incubez-les pendant au moins deux heures à température ambiante jusqu’à utilisation. L’étape suivante consiste à préparer une solution de triss de 10 millimolaires dans de l’eau stérilisée avec un pH de 9,5.

Après avoir filtré la solution, ajoutez de la lectine au mélange jusqu’à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Enduisez ensuite la surface d’une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres avec huit millilitres de solution de lectine et incubez-la pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez la plaque avec HBS S3 fois et stockez-la dans HBSS jusqu’à utilisation.

Après cela, préparez la solution de dépolarisation avec 30 millimolaires de chlorure de potassium et 0,8 % de chlorure de sodium. Stérilisez ensuite le mélange par filtration et conservez-le à température ambiante. Pour commencer cette procédure, décongelez le sérum de cheval pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Ensuite, inactivez-le à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes, aliquote en portions de cinq millilitres et stockez les aliquotes à moins 20 degrés Celsius. Décongeler une aliquote directement à température ambiante avant de l’utiliser dans le magasin suivant B 27. Compléter en aliquotes d’un millilitre à moins 20 degrés Celsius.

Décongeler à température ambiante immédiatement avant utilisation. Évitez les cycles de congélation et de décongélation : aliquote glutamate en aliquotes de 0,5 millilitre et stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Préparez ensuite une solution de tige de 10 microgrammes par millilitre de CNTF dans de l’eau stérilisée avec 0,1 % BSA et stockez-la à moins 20 degrés Celsius.

Enfin, mélangez 46 millilitres de milieu neurobasal avec 2,5 millilitres de sérum de cheval, un millilitre de supplément B 27 et 0,5 millilitre de glutamate. Directement. Ajouter CNTF à une concentration finale du milieu de 10 nanogrammes par millilitre. Préchauffez-le à 37 degrés Celsius.

À ce stade, sacrifiez une souris enceinte embryonnaire de 12,5 et retirez les embryons avec soin. Ajoutez du HBSS à température ambiante pour couvrir complètement les embryons et déplacez un embryon au microscope. Retirez ensuite la tête et la queue et placez l’embryon à l’arrière avec les membres chevauchés.

Ensuite, fixez l’embryon avec une paire de pinces et retirez la peau extérieure avec l’autre paire de pinces. Après cela, retirez la moelle épinière en perçant la pince en dessous et soulevez-la avec des mouvements en forme de scie des deux côtés de la moelle épinière. Transférez la moelle épinière isolée dans une nouvelle boîte avec HBSS.

Ouvrez le canal central de la moelle épinière sur la face dorsale. Ensuite, retirez les ganglions de la racine dorsale en retirant les méninges fermées de la moelle épinière. Transférez ensuite les moelles épinières dans un tube de réaction EOR rempli d’un millilitre de HBSS.

Gardez-les sur de la glace jusqu’à ce que la préparation soit faite pour la digestion de la moelle épinière. Transférez le tube avec les moelles épinières dans une hotte de culture cellulaire. Retirez avec précaution 700 microlitres de HBSS à 7,5 microlitres de solution de tripsin décongelée à 1 %, qui a été préparée plus tôt comme décrit dans le manuscrit ci-joint.

Et mélangez-les en inversant soigneusement le tube. Effectuer l’essai pendant huit minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant 30 microlitres de pipette inhibitrice de trypsine de haut en bas avec précaution, 10 à 15 fois avec une pointe de pipette de 1000 microlitres jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’agrégats cellulaires visibles.

Après cela, répétez l’action avec une pipette de 20 à 200 microlitres. Pipetez la solution cellulaire dans la plaque de lectine remplie de HBSS et dispersez les cellules en tournant doucement la plaque. Couvrez la plaque de lectine pour éviter toute contamination et conservez-la sur une surface sans vibration à température ambiante pendant 60 minutes.

Retirez très doucement le HBSS et lavez soigneusement la plaque quatre fois avec du HBSS préchauffé pour éliminer les fragments cellulaires et les cellules détachées immédiatement après la dernière étape de lavage à 500 microlitres de la solution de dépolarisation de chlorure de potassium à 0,8 % de chlorure de sodium à 30 millimolaires sur la plaque et incubez-la pendant une minute, secouez-la et tapotez la plaque pour faciliter le détachement des cellules liées à la lectine. Remplissez la plaque avec deux millilitres de milieu de culture préchauffé. Transférez-le ensuite dans un tube de faucon de 15 millilitres.

Comptez le numéro de cellule avec une chambre de comptage sans tonnelle Plaque suivante, les cellules sur le couvercle recouvert de laminine. Feuillets ou plaques. Changez le milieu le premier jour et par la suite une fois tous les deux jours en remplaçant soigneusement 50 % de l’ancien milieu par une culture préchauffée et fraîchement préparée.

Le milieu montré ici est une coupe transversale d’une moelle épinière lombaire embryonnaire de 12,5 pouces marquée avec herst pour la localisation des noyaux cellulaires. La flèche indique les colonnes de motoneurones à l’intérieur de la moelle épinière lombaire embryonnaire étiquetées avec un œillet deux anticorps. Un exemple d’œillet un deux étiqueté dissocié.

Les cellules de la moelle épinière lombaire provenant d’embryons embryonnaires 12,5 avant et après le pré-placage à base de lectine sont montrées respectivement sur les panneaux de gauche et de droite. Les résultats quantitatifs des cellules positives de l’œillet un deux avant et après le pré-placage à base de lectine sont présentés ici. Voici un exemple pour montrer que les cellules des motoneurones enrichis au jour zéro et au deuxième jour ont été fixées avec 4 % de paraldéhyde et ensuite colorées pour P 75 NTR.

Selon les procédures standard, ils ont ensuite été contre-colorés à l’aide de crochets pour visualiser tous les noyaux après cinq jours in vitro dans le porno H et stratifiés comme substrats de culture et en présence de CNTF pour la coloration à la bêta-trois tubuline, les cellules ont développé de longs neurites et ont présenté la morphologie typique des motoneurones. Avec un processus plus long et un ou plusieurs processus plus courts. Les motoneurones jouent un rôle central dans le corps de tous les vertébrés et invertébrés.

Cet isolement est extrêmement utile pour l’analyse des mécanismes de survie des motoneurones. Avec les cellules isolées, vous pouvez analyser sélectivement les activités d’autres cellules en interaction, des protéines, des glucides et appliquer des substances pharmacologiques sur la survie et la croissance neurologique de ces cellules.