Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Ce vidéo décrit une procédure permettant de générer des fibroblastes associés aux carcinomes, ou CAF, à partir de cultures primaires de tissu humain. Les carcinomes sont des tissus complexes composés de cellules néoplasiques et d’un compartiment non cancéreux appelé le stroma. Le stroma associé au tumeur comprend la matrice extracellulaire et une variété de cellules stromales, notamment des fibroblastes, des myofibroblastes, des cellules endothéliales, des parasites et des leucocytes. Les fibroblastes associés aux carcinomes, riches en myofibroblastes, constituent un critère caractéristique des fibroblastes activés présents au sein de la tumeur.

Les stromocytes jouent un rôle majeur dans la progression tumorale. Ils peuvent être générés in vitro en isolant d'abord des fibroblastes mammaires humains primaires à partir de tissu mammaire sain obtenu par mammoplastie de réduction. Le tissu obtenu est dissocié en une suspension monocellulaire, puis immortalisé par transduction virale et modifié pour exprimer la GFP et un gène de résistance à la puromycine.

Les cellules sont ensuite co-injectées avec un carcinome du sein humain. Des cellules MCF seven RAs sont injectées par voie sous-cutanée dans une souris immunodéficiente. Les fibroblastes mémoires humains injectés se transformeront en myofibroblastes promoteurs de tumeurs.

Ensuite, les fibroblastes mammaires humoraux parentaux sont extraits de xénogreffes tumorales et cultivés en présence de purémycine. Les cellules résistantes à la purémycine obtenues, appelées fibroblastes associés aux cancers expérimentalement générés ou CAF-EG, une analyse immunohistochimique révèle que les fibroblastes humains normaux initialement présents évoluent en fibroblastes associés aux cancers au sein de la xénogreffe tumorale, acquérant ainsi la capacité de promouvoir la tumorigenèse. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'extraction de CAF primaires à partir de patientes atteintes d'un cancer du sein, est que nous sommes en mesure de générer expérimentalement des CAF à partir de fibroblastes mammaires humains en utilisant une co-implantation tumorale.

Le modèle général illustrant la procédure sera Kar, un chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, et Ahmed Kar, un étudiant au doctorat dans le laboratoire. Commencez avec un gramme de tissu mammaire humain sain prélevé lors d'une mammoplastie de réduction. Lavez le tissu plusieurs fois dans du PBS, puis placez-le dans une boîte de Pétri de 15 centimètres et utilisez une lame de rasoir stérile pour le hacher en petits fragments de moins de 1,5 millimètre cube de taille.

Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour transférer les fragments de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de tampon de dissociation cellulaire pour chaque demi-gramme de tissu. Vortexez ensuite pendant une minute à vitesse maximale. Placez le tube sur un agitateur rotatif dans un incubateur à 37 degrés Celsius et laissez les fragments de tissu digérer pendant 12 à 18 heures.

Le lendemain, de nombreux morceaux de fragments de tissu non digérés seront encore présents dans le vortex du tube. Tout d'abord à vitesse maximale, placez le tube sur le plan de travail et incubez pendant cinq minutes à température ambiante sans agitation. Après l'incubation, utilisez une pipette physiologique de cinq millilitres pour transférer le surnageant enrichi en cellules stromales obtenu dans un nouveau tube conique.

Ensuite, centrifugez la fraction stromale pendant cinq minutes à 250 fois la gravité. Après la centrifugation, remettez en suspension le culot cellulaire dans du PBS, puis centrifugez votre prélèvement pendant cinq minutes à 250 fois la gravité. Resuspendez ensuite le culot dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FCS et transférez-le dans une boîte de Pétri de 15 centimètres.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après huit à dix jours, les cellules doivent être confluentes. À ce stade, les cellules sont récoltées et peuvent être congelées pour un stockage à long terme.

Pour immortaliser les fibroblastes mémoires humains normaux primaires isolés, introduire un vecteur rétroviral PMIG exprimant à la fois H turt et GFP dans la culture cellulaire pendant quatre à cinq jours, puis trier les cellules GFP positives par cytométrie en flux. Introduire un construct rétroviral P babe puro codant pour un gène de résistance à la purémycine dans la culture de fibroblastes immortalisés marqués par GFP. Incuber les cellules pendant cinq à sept jours en présence de purémycine à une concentration finale de un microgramme par millilitre.

Pour isoler les fibroblastes humains mémoires immortalisés résistants à la pur omycine et marqués avec la GFP. Ensuite, vérifier si les fibroblastes produisent des virus actifs, pouvant entraîner le transfert horizontal des gènes codant pour la GFP et la résistance à la pur omycine. Cultiver 2,5 × 10⁵ fibroblastes humains mémoires immortalisés résistants à la pur omycine dans une boîte de Pétri de six centimètres pendant deux jours.

Recueillir et filtrer le milieu conditionné des fibroblastes à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron. Ensuite, ajouter à 10 t et demi de cellules de fibroblastes de souris et cultiver pendant 12 heures en présence de cinq microgrammes par millilitre de sulfate de protéine, ce qui augmente l’efficacité de l’infection virale après 12 heures écoulées. Remplacer le milieu par du DMEM supplémenté en 10 % de FCS et poursuivre la culture pendant deux jours supplémentaires.

Observer les cellules par microscopie à fluorescence. Les cellules T et demie infectées par le virus GFP seront positives au GFP. Remplacer maintenant le milieu pour traiter les cellules avec un microgramme par millilitre.

Sélectionner avec de la puromycine pendant cinq à sept jours. Observer à nouveau les cellules par microscopie de fluorescence afin de déterminer si des cellules témoins résistantes à la puromycine se sont regroupées en colonies. Remarquer que le transfert horizontal de gènes par des virus actifs produits par les fibroblastes mammaires humains parentaux, marqués au GFP et résistants à la puromycine, pourrait rendre résistantes les cellules murines sensibles à la puromycine environnantes ainsi que les cellules de carcinome.

Résistant à la pur mycine et positif pour la GFP au sein du xénogreffe tumorale. Cela pourrait entraver le processus d'isolement des fibroblastes mammaires humains marqués par la GFP et résistants à la pur mycine injectés à partir de la xénogreffe tumorale afin de générer expérimentalement des fibroblastes associés au carcinome pour injection dans une souris immunodéficiente. Commencez par traiter avec la trypsine et compter la lignée cellulaire mammaire humaine fraîchement préparée ainsi que la lignée cellulaire de carcinome du sein humain MCF seven RAs dans de nouveaux tubes microfuges.

Resuspendre une fois 106 cellules de carcinome mammaire humain 77FRAs et trois fois 106 fibroblastes mammaires humains immortalisés, marqués au GFP et résistants à la puromycine, dans 400 microlitres de milieu de culture contenant 50 % de Matrigel par injection. Placer les tubes sur de la glace comme témoin.

Préparez également les mêmes fibroblastes mammaires humains sans les cellules MCF seven RAs. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 27, injectez le mélange cellulaire dans un site sous-cutané d’une souris nue immunodéficiente afin d’examiner la variation intratumorale des phénotypes des cellules souches. Isolez les cellules souches et les fibroblastes témoins de plusieurs xénogreffes tumorales différentes.

Ensuite, implantez chaque mélange dans les régions droite et gauche de chaque souris. Laissez les xénogreffes de tumeur ou de fibroblastes se développer pendant 42 jours après l'injection. La période d'incubation des fibroblastes au sein de la xénogreffe tumorale doit être optimisée en fonction du phénotype de myofibroblaste acquis par les fibroblastes parentaux dans la tumeur.

Pour extraire les fibroblastes de veau ou les fibroblastes témoins du tissu du souris euthanasiée, placer au moins 0,5 gramme de tissu xénogreffe et au moins 0,1 gramme de tissu xénogreffe de fibroblastes dans des boîtes séparées. Ensuite, utiliser une lame de rasoir stérile pour hacher le tissu en petits fragments de moins de 1,5 millimètre cube. Puis utiliser la lame de rasoir pour transférer les fragments de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant le tampon de dissociation cellulaire et vortexer pendant une minute à vitesse maximale. Incuber la suspension cellulaire pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec une agitation lente continue, puis centrifuger la suspension cellulaire.

Dissocier les cellules, soit à partir de la tumeur, soit du greffon en fibre de verre sano, pendant cinq minutes à 250 × g après la centrifugation. Resuspendre le culot cellulaire dans du PBS et répéter la centrifugation. Ensuite, resuspendre le culot cellulaire obtenu dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FCS afin d'isoler une culture de fibroblastes mammaires humains parentaux résistants à la puromycine.

Les cellules issues du tumeur ou des fibroblastes flottent dans une boîte de Pétri de 15 centimètres en présence d'un microgramme par millilitre de puromycine, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ceci éliminera toute cellule carcinomateuse contaminante et/ou murine.

Les cellules stromales propagent les cellules jusqu'à confluence, puis stockent les cellules à moins 80 degrés Celsius en utilisant un milieu de congélation. Notez que les cellules résistantes à la pur mycine obtenues, désignées 42 jours XP veau un ou cellules fibroblastes contrôle un, sont immortelles et positives pour la GFP. Les fibroblastes humains de mémoire augmentent leur phénotype myofibroblastique promoteur de tumeur au sein de la xénogreffe tumorale en interagissant avec les cellules carcinomateuses durant la progression tumorale. Mélangez une fois 10 à la puissance 6 cellules MCF sept RAs et trois fois 10 à la puissance 6 cellules 42 jours veau P.

Une cellule dans 400 microlitres de milieu de culture avec une injection de Matrigel à 50 % dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre. Préparez également trois fois 10 à la puissance 6 cellules de fibroblastes contrôles âgés de 42 jours, sans cellules de carcinome, dans un tube Eppendorf afin de renforcer davantage les phénotypes myofibroblastiques promoteurs de tumeur des cellules exp calf une. Injectez un mélange de ces cellules avec des cellules CF sept RAs par voie sous-cutanée dans une souris nue. Injectez également les cellules de fibroblastes contrôles seules, sans cellules cancéreuses, pour préparer les cellules contrôles si nécessaire.

Incuber les cellules exp calf une pendant des périodes supplémentaires de 200 jours au sein du xénogreffe tumorale afin de générer les cellules exp C deux et renforcer le phénotype myofibroblastique promoteur de tumeur. Générer également les cellules contrôle fibroblastes deux comme témoin face aux cellules exp calf deux, en injectant des cellules fibroblastes contrôle une sans cellules carcinomateuses dans une souris, retirer les tumeurs et les placer dans des boîtes de culture tissulaire.

Dissez et dissociez la tumeur ou le greffon de tissu sénile contenant des fibroblastes en une suspension monocellulaire, puis mettez en culture. Incubez les cellules dans une boîte de Pétri de 15 centimètres avec du DMEM contenant 10 % de FCS, en présence de puromycine, et faites proliférer les cellules jusqu’à ce qu’elles soient complètement détachées par la trypsine. Conservez ensuite les cellules à −80 degrés Celsius à l’aide d’un milieu de congélation. Les cellules résistantes à la puromycine obtenues portent le nom de cellules exp calf deux âgées de 242 jours ou cellules contrôle fibroblastes deux. Les cellules exp calf deux marquées au GFP et les cellules contrôle fibroblastes deux, extraites de xénogreffes de tumeurs mammaires, ont été analysées par immunohistochimie. Comme le montre cette image, les cellules présentent une coloration fortement positive pour les marqueurs mésenchymateux, notamment la prolo-4-hydroxylase spécifique de l’humain, le collagène de type I, la fibronectine, la protéine S100A4 et la protéine de surface des fibroblastes.

Ces résultats indiquent une origine humaine et une nature mésenchymateuse de ces cellules. En revanche, la cytokeratine, un marqueur des cellules épithéliales, n'a pas été détectée dans ces fibroblastes GFP positifs pris ensemble. Ces observations suggèrent que les cellules EXP C deux et les fibroblastes témoins deux proviennent des fibroblastes mammaires humains parentaux initialement introduits dans des xénogreffes chez la souris.

Importamment, un nombre beaucoup plus élevé de cellules XP calf deux marquées positivement pour l'alpha SMA et la glycoprotéine matricielle extracellulaire to nasin C, deux marqueurs des myofibroblastes, a été observé par rapport aux cellules fibroblastes contrôles deux. Noter qu'une proportion plus élevée de myofibroblastes positifs pour l'alpha SMA est présente dans les cellules exp calf deux comparées à celle observée dans les cellules exp calf un de 42 jours. Ces données démontrent que les fibroblastes résidents humains de mémoire évoluent progressivement en myofibroblastes calf au sein de xénogreffes tumorales durant la progression tumorale après leur développement.

Le modèle de xénogreffe tumorale de complémentation a ouvert la voie aux chercheurs travaillant sur le microenvironnement tumoral pour étudier les processus d'évolution des fibroblastes normaux en cellules cancéreuses. Ainsi parle le fibroblaste.